$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
Uwaga: Plazmid używany Lifeact-mCherry jest uprzejmym prezentem od Dr. Guillaume'a Montagnaca, Institut Curie, Paryż.
1. Komórki i transfekcja
Uwaga: Makrofagi RAW264.7 są hodowane do subkonfluencji w kompletnym podłożu (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 podłoże, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu, 2 mM L-Glutaminy i 10% FCS (surowica cielęca płodu)) na płytce 100 mm. Są one transfekowane plazmidami kodującymi fluorescencyjnie znakowane białka za pomocą elektroporacji. Rutynowo około 5 - 6 x 106 komórek jest transfekowanych 20 μg lub 10 μg plazmidu odpowiednio dla każdej transfekcji lub kotransfekcji. Należy pamiętać, że inne metody transfekcji oparte na elektroporacji lub lipofekcji mogą być stosowane jako alternatywne podejścia.
- Zeskrobać komórki za pomocą podnośnika do komórek i ponownie zawiesić je w 10 ml pożywki hodowlanej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.
- Odwirować zawiesinę komórek 300 x g, 5 min przy RT w wirniku o kącie wychylnym.
- Rozgrzać 10 ml kompletnego podłoża uzupełnionego 10 μg/ml gentamycyny w temperaturze 37 °C.
- Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml "buforu płuczącego A" z zestawu do elektroporacji.
- Zawiesinę komórek odwirować 300 x g, 5 min w temperaturze pokojowej w wirniku o kącie wychylnym.
- W międzyczasie przygotuj mieszankę DNA w temperaturze pokojowej: 120 μl 2x bufor B, 20 μg plazmidowego DNA kodującego interesujące nas białko, q.s.p. 240 μl H2O.
- Po odwirowaniu wyrzucić cały supernatant.
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w mieszance DNA i przenieść do kuwet do elektroporacji o średnicy 4 mm.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
- Elektroporacja przy 250 V, 900 μF.
- Natychmiast ponownie zawiesić komórki w podgrzanym (37 °C) kompletnym podłożu uzupełnionym gentamycyną i umieścić je w naczyniu o średnicy 100 mm.
- Inkubować transfekowane komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Następnego ranka zastąp całe podłoże 10 ml pożywki mikroskopowej bez surowicy (RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μM β-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy).
2. Opsonizacja czerwonych krwinek
Uwaga: Jako model celu cząsteczkowego dla makrofagów, używane są czerwone krwinki owiec (SRBC). Zwykle stosuje się około 7 x 106 SRBC na naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
- Przepłukać SRBC 100 μl 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)/0,1% BSA (albumina surowicy bydlęcej) i odwirować (600 x g, 4 min).
- Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić SRBC w 100 μl 1x PBS/0,1% BSA i odwirować (600 x g, 4 min).
- Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić SRBC w 1x PBS/0,1% BSA z króliczymi IgG anty-SRBC w stężeniu subaglutynacyjnym. Użyć 500 μl roztworu zawierającego przeciwciała/5 μl SRBCs.
nuta: Stężenie subaglutynacyjne przeciwciał odpowiada najniższemu stężeniu, które nie wywołało aglutynacji wykrytej jako tworzenie sieci. Ogólnie rzecz biorąc, stężenie subaglutynacyjne wynosi 8,2 μg/ml.
- Określić stężenie IgG anty-SRBC wymagane do opsonizacji SRBC za pomocą testu hemaglutynacji. Stopniowo rozcieńczyć IgG anty-SRBC (zapas w stężeniu 13,1 mg/ml) w proporcjach 1/50 - 1/25 600 na mikropłytce. Dodaj 2 x 106 SRBC do każdej studzienki. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut z powolną rotacją.
- Po dwóch płukaniach w 1x PBS/0,1% BSA, jak opisano powyżej, ponownie zawiesić IgG-opsonizowane SRBC (IgG-SRBCs) we wstępnie podgrzanym pożywce mikroskopowej bez surowicy (2 ml / naczynie).
3. Powłoka polilizynowa szkiełek nakrywkowych
- W międzyczasie potraktuj naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm 2 ml 0,01% poli-L-lizyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj naczynia dwa razy 2 ml 1x PBS.
4. Niekowalencyjne utrwalanie SRBC na naczyniach ze szklanym dnem
- Wlać 2 ml zawiesiny SRBC na szklane naczynie o dnie 35 mm.
- Wirować z wirnikiem wahliwym o sile 500 x g przez 2 minuty na naczyniach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
- Usunąć sklarowany osad i przemyć go raz 2 ml 1x PBS/10% BSA.
- Inkubować cząstki przez 30 minut z 2 ml 1x PBS/10% BSA na naczynie.
- Umyj naczynia trzy razy 2 ml 1x PBS.
- Zastąp 1x PBS 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża mikroskopowego bez surowicy.
5. Fagocytoza wizualizowana przez TIRFM
- Mikroskop
nuta: TIRFM przeprowadzono przy użyciu mikroskopu wyposażonego w obiektyw zanurzeniowy w oleju (N 100X, NA1.49), komorę grzewczą z CO2 oraz dwie kamery do wykrywania pojedynczych fotonów EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) sprzężone z obiektywem 1,5X.
- Dzień przed sesją mikroskopową TIRF włączyć komorę grzewczą na 37 ºC, aby umożliwić jednorodne podgrzanie stolika mikroskopowego.
- Wyznaczanie kąta krytycznego
nuta: Oprogramowanie ImageJ Color Profiler służy do przetwarzania strumieni obrazów TIRF.
- Umieścić pod mikroskopem naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierające opsonizowane SRBC z pożywką mikroskopową bez surowicy.
- Zeskrobać komórki i ponownie zawiesić je w pożywce przed dodaniem ich (100 - 500 μl) do naczynia.
- Użyj oprogramowania "Live Acquisition" do sterowania mikroskopem i przeprowadzenia wzbudzenia za pomocą lasera 491 nm i/lub 561 nm w celu identyfikacji komórek wykazujących ekspresję fluorescencyjnie znakowanych białek.
- Zidentyfikuj komórkę, która wyraża fluorescencyjnie znakowane białka.
- Umieść go na środku pola i uzyskaj 500 obrazów na jednej długości fali wzbudzenia, pod różnymi kątami od 0º do 5º, z krokiem 0,01º (rysunek 1A). Kąty są automatycznie zmieniane przez system mikroskopu.
- Określ kąt krytyczny, aby padające światło zostało całkowicie odbite na granicy szkła / medium i wygeneruj falę ulotną. Za pomocą oprogramowania ImageJ Color Profiler otwórz sekwencję obrazów, klikając "Plik", "Otwórz" i wybierz plik.
- Wybierz obszar zainteresowania (ROI) za pomocą prostokątnego narzędzia w komórce o jednolitej fluorescencji (Rysunek 1B żółty 1).
- Wykreśl "Profil osi Z" średnią intensywność fluorescencji mierzoną w ROI z funkcją kątów na osi x, klikając zakładkę "Obraz", "Stosy" w menu rozwijanym i "Wykres profilu osi Z" (rysunek 1B czerwony 2).
Uwaga: Kąt krytyczny to kąt prowadzący do maksymalnej fluorescencji przed gwałtownym spadkiem fluorescencji.
- Użyj dowolnej wartości kąta na osi x większej niż kąt krytyczny podczas sesji mikroskopowej, aby uzyskać sygnał TIRF, jak w przykładzie 2.00 (Rysunek 1C).
- Przejęcia
- Korzystając z oprogramowania Live Acquisition, ustaw parametry akwizycji za pomocą modułu "Edytor protokołów" (Rysunek 2A).
- Stwórz protokół z "pętlą" obejmującą akwizycję "Multi Channels" w celu uzyskania sygnału fluorescencyjnego z białek będących przedmiotem zainteresowania w regionie TIRF. Wprowadź kąt TIRF (na przykład 2,00), czas naświetlania (na przykład 50 ms) i intensywność lasera (na przykład 50%) (Rysunek 2B 1).
- Wprowadź ruch "Z" celu 3 μm powyżej obszaru TIRF, aby uzyskać akwizycję sygnału w epifluorescencji za pomocą narzędzia "Multi Channels". Wprowadź kąt poniżej kąta krytycznego (jak w przykładzie 1,00), czasu ekspozycji (50 ms) i natężenia lasera (50%) (rysunek 2B, 2 i 3).
- Następnie dodaj ruch "z" celu 3 μm poniżej, aby powrócić do obszaru TIRF (Rysunek 3B 4). Dodaj "migawkę" ogniwa w jasnym świetle LED (dioda elektroluminescencyjna) (rysunek 2B 5).
- Znajdź interesującą komórkę o umiarkowanym poziomie fluorescencyjnie znakowanej ekspresji białka, która inicjuje fagocytozę SRBC poprzez rozszerzenie błony plazmatycznej wokół cząsteczki.
- Umieść go na środku pola.
- Rozpocznij akwizycję strumieniową od 500 do 1 000 klatek. W zakładce "liczba pętli" wpisz "750 klatek" (Rysunek 2B 1).
nuta: Oprogramowanie ImageJ Color Profiler służy do przetwarzania strumieni obrazów TIRF.
- Otwórz obrazy sekwencji w oprogramowaniu Image J, klikając "Plik", "Otwórz" i wybierając plik.
- Oddziel kanały, klikając zakładkę "Obraz", menu rozwijane "Hyperstacks" i funkcję "Stos do hiperstosu". Wypełnij wyświetlone okno: Zamówienie: xyctz; Kanał (c): liczba kanałów (np. "2", jeśli masz dwa fluorochromy); Plasterki (z): liczba wycinków na osi z (np. "1", jeśli nie ma ruchu w osi z); Klatki (t): liczba obrazów podzielona na liczbę kanałów; Tryb wyświetlania: Skala szarości.
nuta: Generowane są dwie oddzielne sekwencje obrazów, odpowiadające dwóm różnym kanałom.
