Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Izolacja gradientu gęstości ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs)
- Dodać 25 ml heparynizowanej krwi pełnej do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 25 ml.
- Rozcieńczyć komórki 25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Dodać 15 ml gradientu gęstości Ficoll-Paque do nowej probówki o pojemności 50 ml i przechylając probówkę, bardzo powoli i ostrożnie dodać 25 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek na gradieniu gęstości, tak aby nie doszło do zmieszania krwi pełnej z gradientem gęstości, tj. nie doszło do zakłócenia granicy faz gradientu gęstości krwi.
- Odwirować zawiesinę od kroku 1.2 przy 400 × g przez 30 do 40 minut w wirniku z kubełkiem wahliwym o regulowanej temperaturze bez hamulca w temperaturze 20 °C.
nuta: Po odwirowaniu powinny być widoczne trzy wyraźne warstwy: górna warstwa to osocze; dolna przezroczysta warstwa jest gradientem gęstości Ficoll-Paque; i cienka, środkowa warstwa komórkowa będąca PBMC.
- Odessać i wyrzucić górną warstwę przez odsysanie pipetą Pasteura, uważając, aby nie naruszyć warstwy interfazowej komórek jednojądrzastych (tj. limfocytów, monocytów i płytek krwi).
- Ostrożnie zebrać tę jednojądrzastą warstwę komórek za pomocą pipety o pojemności 10 ml do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
- Napełnić probówkę 20 ml PBS, dobrze wymieszać i odwirować przy stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 20°C. Po odwirowaniu całkowicie usunąć supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 20 ml PBS i odwirować przy 200 × g przez 10-15 minut w temperaturze 20 °C. Po odwirowaniu całkowicie usunąć supernatant.
nuta: Ten krok usuwa płytki krwi - które są niepożądane - w PBMC; Ten krok można powtórzyć, aby zapewnić całkowite usunięcie płytek krwi.
- Jeśli nie jest pożądana selekcja określonych populacji, ponownie zawieś osad komórkowy w kompletnej pożywce leukocytów (10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny w pożywce RPMI-1640) do hodowli po wykonaniu liczenia komórek w celu zawieszenia 1 ml pożywki na 107 PBMC przed przejściem do następnego kroku.
2. Magnetyczne znakowanie populacji leukocytów
- Odwirować zawiesinę PBMC o stężeniu 300 × g przez 10 minut i całkowicie odessać supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 80 μl PBS na 107 wszystkich komórek.
- Dodać 20 μl określonych kulek magnetycznych (tj. kulek magnetycznych CD14 do izolacji monocytów, kulek magnetycznych CD4 do izolacji limfocytów T) na 107 komórek ogółem.
- Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze od 2 do 8 °C w lodówce.
- Dodać 1-2 ml PBS na 107 komórek do przemycia i odwirować przy 300 × g przez 10 min.
- Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić do 108 komórek w 500 μl PBS.
3. Selekcja magnetyczna subpopulacji leukocytów
Uwaga: Dostępne są różne magnetyczne separatory i kolumny do izolacji określonej populacji leukocytów za pomocą markera powierzchni komórki od wielu producentów. Izolacja może odbywać się przez selekcję pozytywną opartą na jednym lub kilku markerach dodatnich lub przez selekcję negatywną po uszczupleniu niepożądanych populacji. Poniżej przedstawiono ogólne podejście do przeprowadzania selekcji pozytywnej przy użyciu jednego markera (tj. CD4 dla limfocytów T pomocniczych lub CD14 dla monocytów).
- Przygotować i zalać separator magnetyczny wraz z kolumną separacyjną zgodnie z instrukcjami producenta.
- Nałożyć probówkę zawierającą próbkę znakowanych PBMC. Dostarczyć dwie probówki wirówkowe o pojemności 15 ml do pobierania dodatnio znakowanych i nieznakowanych frakcji komórkowych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
- Policz liczbę komórek i ponownie zawieś pozytywnie wybrane leukocyty (tj. Limfocyty T CD4 + lub komórki CD14 +) w kompletnej pożywce leukocytów, używając 1 ml pożywki na 107 komórek.
4. Barwienie estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE) w celu oceny proliferacji
Uwaga: CFSE jest szeroko stosowany w badaniach immunologicznych, zarówno in vivo, jak i in vitro. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem badań in vitro interakcji MSC/PBMC (lub innych leukocytów). Chociaż ogólne etapy związane z przeprowadzaniem znakowania CFSE in vitro są podobne, mogą występować różnice w konkretnej dawce i czasie stosowania protokołu. Może to być spowodowane wieloma czynnikami, tj. konkretnym typem użytych komórek, liczbą użytych komórek - które mogą prawdopodobnie wpływać na intensywność sygnału fluorescencyjnego CFSE.
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy CFSE (10 mM) w PBS do pożądanego stężenia roboczego 10 μM (roztwór roboczy CFSE). Przygotuj 107 komórek (tj. PBMC lub limfocyty T) do znakowania roztworem roboczym CFSE.
- Wirować przy 300 × g przez 10 minut w celu uzyskania osadu komórkowego i zassać supernatant.
- Delikatnie zawiesić komórki w 1 ml wstępnie ogrzanego (37 °C) roztworu roboczego CFSE i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
- Aby zmyć nadmiar CFSE, rozcieńczyć zawiesinę ogniw 10 razy (objętościowo) wstępnie schłodzonego (4 °C) podłoża RPMI zawierającego 10% FBS. Osadzać komórki przez odwirowywanie przy 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Umyj w ten sposób osad komórkowy jeszcze dwukrotnie.
- Ponownie zagnieźlić komórki przez odwirowanie i policz liczbę komórek. Ponownie zawiesić 107 komórek (PBMC lub limfocyty T) w 1 ml świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki leukocytów.
5. Test supresji efektorów Selektywne leukocyty immunomodulujące wywołane przez MSC na aktywowanych limfocytach T CD4 + znakowanych CFSE
- Wysiewać MSCs w 250 000 komórek w 3 ml kompletnego podłoża MSC na płytkach 6-dołkowych (gęstość MSC: 25 000 komórek/cm2) w celu przyłączenia O/N w inkubatorze o temperaturze 37 °C, co pozwala komórkom macierzystym osiągnąć 80% konfluencji. Niezbędne są co najmniej 3 płytki 6-dołkowe, aby zapewnić wystarczającą ilość PBMC współhodowanych przez MSC do selekcji subpopulacji.
- Odessać pożywkę i dodać PBMC oddzielone zgodnie z krokiem 1, ale na płytkach 6-dołkowych w proporcjach 2,5 x 106 komórek/dołek (gęstość komórek: 250 000 leukocytów/cm2) z 3 ml kompletnej pożywki leukocytów. Współhodowla przez 48-72 godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
- Specyficzna populacja leukocytów immunomodulujących indukowanych przez MSC (tj. komórek CD14 +) swoista do kulek magnetycznych, zgodnie z sekcjami 2-3.
nuta: W tym momencie można przeprowadzić barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej w celu oceny zmian w profilu ekspresji cytokin leukocytów, tj. ekspresji interleukiny-10-modulowanej przez MSC.
- Dodaj znakowane CFSE allogeniczne limfocyty T CD4 + wygenerowane zgodnie z sekcjami 2-4 na 24-dołkowych płytkach w 1 ml kompletnej pożywki leukocytów (gęstość limfocytów T: 250 000 komórek / cm2) do wybranych przez kulki leukocytów indukowanych przez MSC w różnych proporcjach, tj. Proporcje 1:10, 1:5, 1:2 i 1:1 (komórka do komórki).
- Aby stymulować limfocyty T CD4 +, dodaj α-CD3 / 28 sprzężone mikrogranulki, aby uzyskać stosunek kulek do komórek 1: 1.
- W celu kontroli ujemnej umieść 500 000 limfocytów T CD4 + / basenik na 24-dołkowej płytce (gęstość limfocytów T: 250 000 komórek / cm2) tylko z 1 ml kompletnej pożywki leukocytów; w celu kontroli pozytywnej, oprócz posiewu tej samej liczby limfocytów T CD4 + / basenik, dodaj α-CD3 / 28 sprzężonych mikrogranulek, aby uzyskać stosunek kulek do komórek 1: 1.
- W 3 dniu kohodowli ocenić proliferację limfocytów T CD4 + znakowanych CFSE (umieszczonych w probówkach okrągłodennych) za pomocą analizy cytometrii przepływowej z filtrami wzbudzenia i emisji 488 nm odpowiednimi dla fluoresceiny.