Technologia IgY: Wyodrębnianie przeciwciał kurzych z żółtka jaja poprzez wytrącanie glikolem polietylenowym (PEG)

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje w szczególności ekstrakcję całkowitego IgY z żółtka jaja za pomocą precypitacji glikolem polietylenowym i przekazuje ogólne informacje na temat technologii IgY.

Streszczenie

Kury można immunizować poprzez szczepienie domięśniowe (i.m.) (Musculus pectoralis, lewy i prawy, objętość wstrzyknięcia 0.5-1.0 ml) lub za pomocą immunizacji plazmidowej przy użyciu genu-pistoletu (Gene-Gun). W zależności od immunogenności antygenu, wysokie miana przeciwciał (do 1:100 000 – 1:1 000 000) można osiągnąć już po jednej lub 3–4 dawkach przypominających. Zazwyczaj kura znosi jaja w sposób ciągły przez około 72 tygodnie, po czym wydajność znoszenia spada. Niniejszy protokół opisuje ekstrakcję całkowitego IgY z żółtka jaja za pomocą procedury wytrącania (PEG, Polson et al. 1980). Metoda ta obejmuje dwa kluczowe etapy. Pierwszym jest usuwanie lipidów, a drugim wytrącanie całkowitego IgY z nadfiltratu uzyskanego w pierwszym kroku. Po dializie przeciwko buforowi (zazwyczaj PBS) ekstrakt IgY można przechowywać w temperaturze -20°C przez ponad rok. Czystość ekstraktu wynosi około 80%, a całkowita ilość IgY na jajo waha się od 40-80 mg, w zależności od wieku nioski. Całkowita zawartość IgY wzrasta wraz z wiekiem kury od około 40 mg/jajo do 80 mg/jajo (w odniesieniu do wytrącania PEG). Roczna wydajność znoszenia jaj przez jedną kurę wynosi około 325 jaj. Oznacza to całkowity potencjalny zbiór 20 g całkowitego IgY/rok, zakładając średnią zawartość 60 mg całkowitego IgY/jajo (patrz Tabela 1).

Protokół

1. Protokół - ekstrakcja IgY za pomocą wytrącania PEG

Ryc. 1 przedstawia schemat procedury ekstrakcji IgY (patrz tabela 2). Protokół ten został po raz pierwszy opisany przez Polson et al. 1980.
Wszystkie etapy należy przeprowadzać w rękawiczkach lateksowych.

1. Skorupka jaja jest ostrożnie rozbijana, a żółtko przenoszone na „łyżkę do żółtek” w celu usunięcia jak największej ilości białka jaja.
2. Żółtko przenosi się na papier filtracyjny i toczy, aby usunąć pozostałości białka, a następnie błonę żółtka nacinając lancetem lub podobnym narzędziem (końcówką do pipety). Żółtko wlewa się do probówki o pojemności 50 ml i odnotowuje objętość jaja (V1).
3. Żółtko miesza się z dwukrotnością jego objętości w PBS (∑V1+V2), po czym dodaje się 3,5% PEG 60 (w gramach, sproszkowany) w stosunku do całkowitej objętości i miesza na vortexie, a następnie toczy przez 10 min w mieszalniku obrotowym. Ten etap procedury ekstrakcji rozdziela zawiesinę na dwie fazy. Jedna faza składa się z „ciał stałych i substancji tłustych żółtka” (cytat oryginalny z Polson et al. 1980), a druga z fazy wodnej zawierającej IgY i inne białka.
4. Probówki wiruje się w temperaturze 4°C przez 20 min (10 0 rpm, co odpowiada 13 0 x g, Heraeus Multifuge 3SR+, rotor z kątem stałym). Nadfiltr (V3) przelewa się przez złożony filtr i przenosi do nowej probówki.
5. Do probówki dodaje się 8,5% PEG 600 w gramach (obliczone zgodnie z nową objętością), miesza na vortexie i toczy w mieszalniku obrotowym, analogicznie do kroku 3.
6. Powtarza się krok 4, z tą różnicą, że nadfiltr zostaje usunięty.
7. Osad ostrożnie rozpuszcza się w 1 ml PBS za pomocą szklanej rurki i vortexa. Dodaje się PBS do uzyskania objętości końcowej 10 ml (V4). Roztwór miesza się z 12% PEG 60 (w/v, 1,2 gram) i poddaje obróbce zgodnie z krokiem 3 (vortex, mieszalnik obrotowy).
8. Powtarza się krok 6 i ostrożnie rozpuszcza osad w 80 μl PBS (szklana rurka i vortex). Należy odczekać do zniknięcia pęcherzyków powietrza, a następnie przenieść (pipetą) ekstrakt do kapsuły dializacyjnej. Probówkę płucze się 40 μl PBS i dodaje tę objętość do urządzenia dializacyjnego (V5). (W kwestii przygotowania urządzeń i membran dializacyjnych patrz w dodatku).
9. Ekstrakt dializuje się przez noc w 0,1% roztworze soli fizjologicznej (1 60 ml), delikatnie mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnego dnia roztwór soli zastępuje się PBS i dializuje przez kolejne trzy godziny.
10. Następnie ekstrakt IgY wyciąga się z kapsuły dializacyjnej pipetą i przenosi do probówek 2 ml. Objętość końcowa wynosi około 2 ml (V6).
11. Zawartość białka (mg/mL) w próbkach mierzy się fotometrycznie przy 280 nm (rozcieńczenie 1:50 w PBS) i oblicza zgodnie z prawem Lamberta-Beera, przyjmując współczynnik ekstynkcji 1,3 dla IgY (patrz Rys. 2); Rys. 4 przedstawia jakość preparatu (czystość i odzysk wynoszą około 80%).
12. Zaleca się przechowywanie próbek w alikwotach w temperaturze -20°C (nie zamrażać próbek w temperaturze -70°C).
13. Jakość końcowych preparatów analizuje się za pomocą prostej metody SDS-PAGE, zgodnie z opisem w protokole JoVE https://www.jove.com/details.php?id=1916

2. Dodatek – przed użyciem woreczek do dializy należy przygotować w następujący sposób, zgodnie z zaleceniami producenta:

1. 20 worków do dializy tnie się na kawałki o długości 30 cm i umieszcza w szklance gradurowanej o pojemności 20 ml.
2. Dodaje się 1,750 ml 5 mM roztworu EDTA.
3. Nad workami umieszcza się lejek szklany, aby upewnić się, że są one całkowicie przykryte roztworem EDTA. Roztwór podgrzewa się i gotuje przez 5 min (na płycie grzejnej). Następnie roztwór odlewa, a worki płucze trzy razy wodą destylowaną.
4. Ponownie dodaje się 1,750 ml roztworu EDTA, gotuje przez 5 min i płucze trzy razy wodą destylowaną w sposób opisany powyżej.
5. Na koniec worki do dializy gotuje się przez 10 min w wodzie destylowanej i przechowuje w temperaturze 4°C. Worki do dializy wyjmuje za pomocą wysterylizowanej pęsety.

3. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Schemat ekstrakcji IgY za pomocą wytrącania glikolem polietylenowym zgodnie z oryginalnym opisem Polsona i in.. 1980. Aby wyświetlić powiększony obraz, kliknij tutaj.

Rycina 2. Kształtowanie się całkowitej zawartości IgY w żółtkach jaj u immunizowanych kur w zależności od wieku. Podano średnią tygodniową zawartość całkowitego IgY/jajo oraz SD (n = 4 kur niosek). Z [Pauly i in. 2009]).

Rysunek 3. Monitorowanie wydajności niesienia czterech kur uodpornionych różnymi antygenami. Strzałki wskazują daty immunizacji (z [Pauly i wsp. 2009]).Aby wyświetlić powiększony obraz, kliknij tutaj.

Rysunek 4. Elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie poszczególnych preparatów IgY z różnych jaj w warunkach redukujących
Ścieżka 1 – marker masy cząsteczkowej, ścieżka 2 – standard IgY, ścieżki 3–5 – różne próbki IgY przygotowane zgodnie z opisem w protokole. Są to preparaty końcowe zgodnie z krokiem 10 protokołu. HC – łańcuchy ciężkie, LC – łańcuchy lekkie, ? – niewielkie zanieczyszczenia odpowiadające masie cząsteczkowej około 35 kDa (prawdopodobnie fragment C-końcowy prekursora witellogeniny II, [Klimentzou i wsp.., 2006]).

	Kura 21 (Antygen A)	Kura 2 (Antygen A)	Kura 19 (Antygen B)	Kura 23 (Antygen C)
Liczba jaj (całkowite IgY)1, okres 2 lat	625 (38 g)	626 (38 g)	545 (3 g)	608 (37 g)
Liczba jaj (całkowite IgY), pierwszy rok	345 (20 g)	304 (16 g)	326 (18 g)	308 (17 g)
Liczba jaj (całkowite IgY), drugi rok	280 (18 g)	32 (21 g)	219 (15 g)	300 (20 g)
% maksymalnej możliwej liczby jaj (pierwszy rok)2	106	93	10	95
% maksymalnej możliwej liczby jaj (drugi rok)	86	9	67	92
liczba przetworzonych jaj	565	620	283	401

¹Ilość całkowitego IgY oblicza się mnożąc liczbę jaj przez średnią wartość 60 mg białka na jajo, zgodnie z danymi przedstawionymi na Rysunku 2.

²Maksymalna możliwa liczba jaj rocznie wynosi 325, zgodnie z informacją od hodowcy.

Tabela 1. Statystyki dwuletnie dotyczące zdolności do niesienia jaj u kur uodpornionych różnymi antygenami. Zdolność do niesienia jaj wyrażona jako procent maksymalnej wydajności czterech kur po immunizacji różnymi antygenami, a także wynik uzyskania IgY w ciągu dwóch lat (patrz również Rys. 3, [Pauly et al. 209]).

Nr jaja	Nr kury / Data zniesienia	V1[ml] żółtko	V2[ml] PBS	1. PEG prec. [g]	Obj. [ml] po	2. PEG prec. [g]	Osad	3. PEG prec. [g]	Osad	Obj. [ml]	Całkowite białko mg/ml	Skorygowane całkowite białko mg/ml
			2xV1 ∑V1 + V2	3,5% [w/v] ∑V1 + V2	prec., centrif. i filtracja V3	8,5% [w/v] V3	rozpuszczony w ml PBS V4	12% [w/v] V4	Rozpuszczony w ml PBS V5	Po dializie przeciwko PBS V6	A280/ml	A280/ml:1.3
1	H293 / 2.10.	15	30 45	1.58	31	2.63	10	1.2	1.2	1.7	35.0	26.3
2	H293 / 23.10.	13	26 39	1.37	25	2.12	10	1.2	1.2	1.7	28.8	21.6

Tabela 2. Przykładowy protokół wytrącania PEG

Dyskusja

Wybór odpowiedniej metody oczyszczania IgY zależy od skali oczyszczania (laboratoryjnej lub przemysłowej), opłacalności, dostępnej technologii (wyposażenia laboratoryjnego) oraz wpływu na środowisko (gospodarki odpadami). Różne metody ekstrakcji IgY zostały szczegółowo omówione przez De Meulenaer & Huyghebaert (2001, przegląd ten przedstawiono również w pracy Schade et al. 2005). Ogólnie metody te można podzielić na trzy główne grupy:

1. Metody wytrącania: wykorzystujące siarczan amonu lub sodu, glikol polietylenowy (PEG), kwas kaprylowy oraz karagenian.
2. Metody chromatograficzne: chromatografia powinowactwa, chromatografia wymiany jonowej, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia oddziaływań tiofilowych oraz chromatografia żelowa.
3. Ultrafiltracja.

Czystość preparatu IgY można zwiększyć poprzez zastosowanie kombinacji metod; na przykład wytrącanie PEG można połączyć z chromatografią powinowactwa. W niektórych przypadkach, w zależności od końcowego zastosowania, ekstrakt wodny IgY jest wystarczający do uzyskania dobrych wyników (Akita & Nakai 1993). Z naszego doświadczenia wynika, że próbka IgY otrzymana poprzez wytrącanie PEG sprawdziła się bardzo dobrze w wielu różnych analizach immunologicznych. Dzięki standaryzacji metody wytrącania PEG jeden asystent techniczny jest w stanie przetworzyć około 84 jaj tygodniowo, co odpowiada ilości całkowitego IgY od 4 do 7 g na tydzień. Proste obliczenie: nioska zostaje zimmunizowana antygenem. Po kilku dawkach przypominających kura produkuje specyficzne przeciwciała (Ab) o mianie 1:50 000 w okresie 30 dni. 30 jaj x 2 ml ekstraktu IgY (patrz protokół i Ryc. 3) odpowiada 60 ml całkowitego IgY, co z kolei odpowiada rozcieńczeniu Ab wynoszącemu 3 000 l (pojemność wiadra wynosi 10 l), co oznacza, że 3 000 l roztworu Ab pozwala napełnić 300 wiader. Zatem, biorąc pod uwagę tak ogromną ilość Ab, przechowywanie puli Ab o stałej jakości i swoistości nie stanowi problemu. Technika ta redukuje zmienność między partiami, która jest zazwyczaj obserwowana w przypadku przeciwciał polispecyficznych.

Pomijając kwestię ilości, przeciwciała IgY wykazują dodatkowe zalety w porównaniu z ssaczymi IgG: brak aktywacji ssaczego układu dopełniacza, brak reaktywności krzyżowej z HAMA (ludzkimi przeciwciałami przeciwko przeciwciałom mysim), czynnikami reumatoidalnymi lub antygenami grup krwi człowieka (brak heteroaglutynin).

Wyjątkową zaletą przeciwciał IgY jest tzw. dystans filogenetyczny. Dystans filogenetyczny jest przyczyną często opisywanych różnic w specyficzności przeciwciał u ssaków i kurcząt, nawet przy identycznej immunizacji. Oprócz różnic między samym układem odpornościowym ssaków i ptaków, do odmiennej specyficzności przeciwciał przyczyniają się różnice w rozwoju filogenetycznym tych dwóch klas zwierząt. Kilku autorów wskazało, że kurczęta często produkują przeciwciała przeciwko filogenetycznie wysoce konserwatywnym białkom lub peptydom ssaków efektywniej niż króliki (przegląd w Schade et a. 2005). W konsekwencji konserwatywny antygen może pozostać „zamaskowany” dla układu odpornościowego królika, wywołując tym samym jedynie słabą lub „milczącą” odpowiedź. Co więcej, jeśli kurczęta i króliki zostaną zimmunizowane tym samym antygenem ssaczym, kurczęta bardzo często odpowiadają specyficznością przeciwciał, której rzadko udaje się osiągnąć u królików. Ważny jest również aspekt dobrostanu zwierząt, ponieważ przeciwciała są pozyskiwane nieinwazyjnie z żółtka jaja. W połączeniu z immunizacją za pomocą armatki genowej (plazmidowej), produkcja IgY jest całkowicie nieinwazyjna (Witkowski et al. 2009).

Podsumowując, produkcja przeciwciał w organizmach kur oraz ekstrakcja IgY za pomocą wytrącania PEG jest bardzo kosztowo efektywna i pozwala na uzyskanie przeciwciał o wysokiej swoistości i stabilnych mianach do 1:1 000 000. Ze względu na odległość filogenetyczną między Aves a Mammalia, kury są w stanie produkować swoiste przeciwciała przeciwko wysoko konserwowanym antygenom ssaków, w przeciwieństwie np. do królików. Nadzwyczajna ilość przeciwciał uzyskiwana dzięki technologii IgY otwiera również drogę do zastosowania przeciwciał IgY w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej do celów terapeutycznych i profilaktycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Worek do dializy Visking, typ 27/32, próg odcięcia -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy Probówki Falcon Blue Max, probówka stożkowa 50 ml z polipropylenu, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, USA Filtr fałdowany MN 615 ¼, 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy Heraeus Mieszadło magnetyczne, Variomag Mono, H+P Labortechnik AG, OberschleißHeim, Niemcy kapsułka do mikrodializy 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy Multifuge 3SR+, Thermo Scientific, Langenselbold, Niemcy Fotometr UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Niemcy glikol polietylenowy 6000, Rotipuran Ph. Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy Gotowy do użycia bufor PBS 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy Mieszadło walcowe SRT2, Stuart, Staffordshire, UK Vibrofix VF2, Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i.Br., Niemcy Łyżka do żółtek, Fackelmann (artykuły gospodarstwa domowego), Niemcy