Badanie przepływu in vitro wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów

Streszczenie

Źródło: Munir, H. et al., Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu. J. Vis. Exp.(2015)

Film demonstruje metodę badania wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów. W modelu komory z przepływem równoległym cytokiny prozapalne indukują ekspresję receptorów adhezyjnych przez komórki śródbłonka, ułatwiając rekrutację i migrację neutrofili. Wzajemne oddziaływanie między komórkami zrębu a komórkami śródbłonka zmniejsza rekrutację neutrofili do komórek śródbłonka.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka ludzkiego i mezenchymalnych komórek macierzystych

1. Izolacja i hodowla komórek śródbłonka żyły pępowinowej człowieka (HUVEC):
   1. Połóż pępowinę na tacy z ręcznikami papierowymi i spryskaj ją 70% etanolem. Umieścić w kapturze do hodowli tkankowej. Zidentyfikuj żyłę i kanelację na obu końcach. Umieść opaskę kablową wokół kaniulowanego końca, aby go zabezpieczyć.
   2. Zmyć krew żylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą strzykawki. Napełnić strzykawkę powietrzem i przepuścić przez żyłę, aby usunąć i wyrzucić resztki PBS.
   3. Rozmrozić 10 mg/ml kolagenazy typu Ia i rozcieńczyć w stosunku 1:10 w PBS (z chlorkiem wapnia i magnezu) do końcowego stężenia 1 mg/ml. Przepuścić roztwór kolagenazy do żyły, aż obie kaniule zostaną wypełnione. Zamknij zaciski na kaniulach na obu końcach.
   4. Przykryj tacę chusteczką i spryskaj 70% etanolem. Umieścić przewód w inkubatorze na 20 minut w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO₂ ).
   5. Wyjmij przewód z inkubatora i dokręć opaski kablowe. Delikatnie masuj pępowinek przez 1 minutę. Przepłukać zawiesinę komórkową 10 ml PBS i zebrać w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
   6. Napełnić strzykawkę powietrzem i przepuścić przez żyłę w celu dwukrotnego usunięcia pozostałości PBS, zbierając PBS do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml użytej w kroku 1.1.5. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki z kompletnych komórek śródbłonka (EC). Pożywka EC składa się z M199 uzupełnionego 35 μg/ml siarczanu gentamycyny, 10 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu, 1 μg/ml hydrokortyzonu, 2,5 μg/ml amfoterycyny B i 20% płodowej surowicy cielęcej.
   8. Dodać 4 ml pożywki EC i zawiesinę EC do kolby o średnicy^{25 cm2}. Zmień podłoże następnego dnia, a następnie co 2 dni.
   9. EC wykazuje morfologię podobną do kostki brukowej (ryc. 1Ai). W przypadku testów adhezji EC są zazwyczaj wysiewane, gdy osiągną 100% konfluencji (patrz sekcja 1.4).
2. Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych Galaretki Whartona (WJMSC) z ludzkiej pępowiny:
   1. Wyizolować galaretowaty MSC Whartona (WJMSC) ze świeżej pępowiny lub z pępowiny, która została już użyta do wyizolowania EC. Przetnij pępowinę na kawałki o długości 5 cm. Przetnij każdy kawałek wzdłuż, aby odsłonić naczynia krwionośne (2 tętnice [białe, sztywne] i 1 żyła [żółta, rozdęta]).
   2. Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy usuń naczynia krwionośne i wyrzuć. Pokrój całą tkankę na 2 - 3 mm³ kawałki. Za pomocą kleszczy umieść 2 - 3 mm³ kawałki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
   3. Rozmrozić 100 mg/ml kolagenazy podstawowej typu II i rozcieńczyć w stosunku 1:100 w 10 ml PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml. Rozmrozić 20 000 U/ml hialuronidazy podstawowej i rozcieńczyć w stosunku 1:400 do końcowego stężenia 50 U/ml w roztworze kolagenazy.
   4. Dodaj koktajl enzymatyczny do probówki wirówkowej zawierającej fragmenty tkanek. Inkubować fragmenty tkanek przez 5 godzin w temperaturze 37 °C na wolnym rotatorze.
   5. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:5 w PBS. Umieść filtr porowy o wielkości 100 μm w nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Wlej zawiesinę komórek na filtr porowy 100 μm.
      nuta: Pozostałe fragmenty tkanek zostaną zatrzymane na filtrze, a komórki zostaną zebrane w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
   6. Wyrzuć filtr. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad WJMSC w 12 ml kompletnej pożywki hodowlanej WJMSC (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco, DMEM o niskiej zawartości glukozy, 10% płodowa surowica cielęca (FCS) i 100 U/ml penicyliny + 100 μg/ml mieszaniny streptomycyny).
   7. Wysiać wszystkie komórki w kolbie do hodowli tkankowych o długości 75^cm2. Po 24 godzinach zmienić pożywkę na 12 ml kompletnej pożywki hodowlanej WJMSC. Wymieniaj podłoże co 2 - 3 dni. Komórki powinny osiągnąć 70 - 80% zbieżności w ciągu 2 tygodni. Pasaż, gdy WJMSC osiąga 70 - 80% zbiegowiska (patrz punkt 1.4).
3. Ekspansja MSC pochodzącego ze szpiku kostnego (BMMSC):
   1. Wyizolować MSC pochodzące z ludzkiego szpiku kostnego (BMMSC), jak opisano wcześniej. Dodać 10 ml wstępnie podgrzanych mezenchymalnych komórek macierzystych, pożywki wzrostowej MSC (MSCGM) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
   2. Rozmrozić fiolkę p2 BMMSC, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 minuty. Dodać zawiesinę BMMSC do probówki wirówkowej zawierającej MSCGM. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
   3. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odessać supernatant.
   4. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml MSCGM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub cyfrowego licznika komórek, takiego jak celometr.
   5. Komórki nasienne do 75 cm² kolby hodowlane o gęstości 5 000 - 6 000 komórek na cm² w 12 ml MSCGM. Zmień podłoże po 24 godzinach za pomocą 12 ml MSCGM. Podawaj komórkom 12 ml MSCGM co 2 - 3 dni.
   6. Pasaż, gdy BMMSC osiąga 70 - 80% zbiegu (patrz punkt 1.4). Komórki wykazują morfologię fibroblastyczną (ryc. 1Aii).
4. Oddział Komisji Europejskiej i MSC:
   1. Odessać podłoże z 25 cm² kolby hodowlane. Dodać 2 ml 0,02% kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) przez około 2 minuty. Odessać EDTA i dodać 2 ml trypsyny (2,5 mg/ml). Oglądaj pod mikroskopem, aż komórki staną się okrągłe.
   2. Stuknij w kolbę, aby odłączyć komórki. Dezaktywować trypsynę, dodając 8 ml pożywki hodowlanej (w zależności od typu komórki; Pożywka EC dla HUVEC, DMEM LG dla WJMSC i MSCGM dla BMMSC) do kolby hodowlanej i przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
   3. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w sposób opisany poniżej.
      1. W celu pasażowania MSC należy ponownie zawiesić osad w pożywce o pojemności 3 ml. Dodać 11 ml pożywki do trzech oddzielnych kolb hodowlanych^{o średnicy 75 cm 2}. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej kolby hodowlanej (podział 1:3). Pasaż WJMSC i BMMSC 3 razy (p3) przed użyciem w testach kohodowlanych.
      2. Dla wysiewu EC lub MSC w testach adhezji – patrz sekcje 2 i 3.
5. Zamrażanie MSC:
   1. W przejściu 3 odczepić MSC zgodnie z opisem w sekcji 1.4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 3 ml lodowatego CryoSFM. Odpipetować 1 ml porcji zawiesiny komórkowej do 1,5 ml lodowatych kriowialiów. Umieść kriowiale w pojemniku do zamrażania.
   2. Przechowywać pojemnik w temperaturze -80 °C O/N. Przenieść do ciekłego azotu. Rozmrozić fiolkę z MSC (wykonaj kroki 1.3.1 - 1.3.6). Zawiesić MSC w pożywce o pojemności 5 ml (wybrać odpowiednią pożywkę dla WJMSC lub BMMSC) i rozsiać nasiona do kolby o średnicy²⁵ cm2.

2. Ustalanie kokultur śródbłonkowo-mezenchymalnych komórek macierzystych na filtrach

1. Odłączyć WJ lub BMMSC zgodnie z opisem w rozdziale 1.4. Zawiesić osad w 1 ml MSCGM. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru lub celometru.
2. Dostosować objętość tak, aby końcowe stężenie wynosiło 5 x^10,5 MSC w 500 μl MSCGM.
3. Za pomocą sterylnych kleszczy odwróć 6-dołkowe filtry PET Transwell 0,4 μm i umieść je w sterylnym pudełku.
4. Rozsiać ziarno 5 x 10⁵ MSC na zewnętrznej powierzchni filtrów. Inkubować filtry w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 1 godzinę.
5. Zbierz media z zewnętrznej powierzchni filtra. Policz liczbę nieprzylegających MSCs w pożywce. Ponownie odwróć filtry za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść je na pasującej 6-dołkowej płytce zawierającej 3 ml MSCGM.
6. Dodać 2 ml MSCGM na wewnętrzną powierzchnię filtra (rysunek 1B). Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 24 godziny. Trypsynizować zlewającą się kolbę EC o długości 25^cm2 (Rysunek 1Ai; jak w sekcji 1.4).
7. Ponownie zawiesić EC w 8 ml MSCGM (kolba 1 x 25 cm² wysieje cztery 6-dołkowe filtry; ~5 x 10⁵ EC / filtr). Zassać pożywkę od góry i od dołu porowatych filtrów. Dodaj 3 ml świeżego MSCGM do dolnej komory (pod filtrem). Dodać 2 ml zawiesiny EC na wewnętrzną powierzchnię każdego filtra. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
8. Odessać pożywkę, aby zmyć nieprzylegającą EC i zastąpić ją świeżym MSCGM. Ustaw równoległe filtry monokultury EC, wysiewając komórki na wewnętrznej powierzchni bez uprzedniego wysiewu MSC. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
9. Sprawdź, czy monowarstwa EC zlewa się i nie zawiera przerw. Monowarstwy subkonfluentne nie mogą być używane do testów adhezji (rysunek 1B).
10. Rozmrozić 1 x 10⁵ U/ml podstawowego czynnika martwicy nowotworu-alfa (TNFα) i rozcieńczyć 1:1,000 w MSCGM do końcowego stężenia 100 U/ml (co odpowiada ~10 ng/ml). Przeprowadzić rozcieńczenie szeregowe, rozcieńczając 100 U/ml TNFα w stosunku 1:10 w MSCGM, aby uzyskać 10 U/ml. Rozcieńczyć 10 U/ml TNFα w stosunku 1:10 w MSCGM, aby uzyskać 1 U/ml.
11. Traktować górną i dolną komorę filtrów 1, 10 lub 100 U/ml TNFα (co odpowiada ~10 ng/ml) w temperaturze 37 °C przez 4 godziny przed testem.

3. Izolacja leukocytów

1. Pobrać krew żylną od zdrowych ochotników i natychmiast poddzielić ją do probówek EDTA. Delikatnie odwróć probówki, aby wymieszać.
2. Warstwę 2,5 ml Histopaque 1077 na 2,5 ml Histopaque 1119 w 10 ml probówce z okrągłym dnem. Nałożyć 5 ml krwi pełnej na gradient hisopaki. Wirować przy 800 x g przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
3. Zebrać obwodowe wielojądrzaste neutrofile (PMN) na granicy faz histopaque 1077 i 1119 (powyżej warstwy erytrocytów). Umieścić w 10 ml probówce z okrągłym dnem i uzupełnić do 10 ml PBSA. Delikatnie odwrócić probówkę i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Rozcieńczyć 7,5% roztwór BSA w stosunku 1:50 w 100 ml PBS (z chlorkiem wapnia i magnezu) do końcowego stężenia 0,15% (w/v; PBSA). Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml PBSA. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Zawiesić w 1 ml PBSA. Pobrać 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórek i dodać do 380 μl PBSA (rozcieńczenie 1:20). Policz komórki za pomocą hemocytometru lub celometru. Rozcieńczyć do wymaganego stężenia (1 x 10⁶/ml dla filtrów Transwell i mikroszkiełka Ibidi) w PBSA. Zawiesinę neutrofili należy utrzymać w temperaturze pokojowej do czasu przeprowadzenia testu.

4. Montaż systemu przepływu

1. Skonfiguruj system przepływu, jak pokazano na rysunku 1C. Włączyć grzałkę i ustawić ją na 37 °C. Podłączyć strzykawkę o pojemności 20 ml (wyjąć tłok) i strzykawkę o pojemności 5 ml do kranu 3-kierunkowego. Przymocuj kran do komory z pleksiglasu za pomocą taśmy Micropore.
2. Zmierz i wytnij długi kawałek silikonowej rurki o grubości 2/4 mm (grubej), która odpowiada w przybliżeniu odległości między zaworem a kranem 3-drogowym. Wytnij kawałek rurki 1/3 mm (cienkiej) o długości 8 - 10 mm i włóż go do jednego końca grubej rurki. Przymocuj grubą stronę rurki do kranu 3-kierunkowego.
3. Podłącz końcówkę cienkiej rurki do portu elektronicznego mikrozaworu 3-drogowego. To jest "zbiornik do mycia". Wytnij kawałek grubej i cienkiej rurki o długości 6 - 8 mm.
4. Włóż cienką rurkę do jednego końca grubej rurki. Podłączyć grubą końcówkę rurki do strzykawki o pojemności 2 ml (wyjąć tłok).
5. Podłącz końcówkę cienkiej rurki strzykawki o pojemności 2 ml do portu na elektronicznym mikrozaworze, aby utworzyć "zbiornik na próbkę". Podłącz zawór do komory przepływu filtra, mierząc i przecinając długi kawałek cienkiej rurki, który jest odległością między mikrozaworem a środkiem stolika mikroskopu.
6. W przypadku modelu z mikroprowadnicą przymocuj kawałek grubej rurki o grubości 8 - 10 mm do końca cienkiej rurki. Umieść łącznik w kształcie litery L na końcu grubej rurki. Spowoduje to połączenie z mikroszkiełkiem. W przypadku modelu filtra należy przymocować kawałek manometru Portex Blue Line o średnicy 8 - 10 mm, łączący rurkę z końcem cienkiej rurki.
7. Umieść cienki koniec rurki na mikrozaworze. Jest to wspólne wyjście dla zbiorników do płukania i pobierania próbek. Napełnij zbiorniki PBSA. Zalać rurki, przepływając przez nie PBSA, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
8. Podłącz rurkę manometru do szklanej strzykawki o średnicy 29 mm (50 ml). Zalać strzykawkę, napełniając ją 10 ml PBSA. Odwrócić strzykawkę tak, aby koniec połączony z rurką był skierowany do góry i wypchnąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Uzupełnić 5 ml PBSA.
9. Tylko w przypadku modelu z mikrosuwakiem przymocuj kawałek grubej rurki o grubości 10 - 12 mm do końca rurki manometru prowadzącej do szklanej strzykawki. Umieść łącznik w kształcie litery L na końcu grubej rurki. Umieścić szklaną strzykawkę w pompie strzykawkowej w celu infuzji/pobrania.
10. Oblicz natężenie przepływu napełniania (Q) wymagane do wygenerowania żądanego naprężenia ścinającego ścianki (τ_w w Pascalu, Pa) wynoszącego 0,1 Pa (filtry Transwell) lub 0,05 Pa (mikroszkiełka Ibidi) za pomocą następujących wzorów:
    γ_W = (6. Q) / (w.h²)
    τ = n.γ
    Gdzie w = szerokość wewnętrzna, a h = głębokość wewnętrzna kanału przepływowego. n = lepkość przepływającego roztworu; PBSA wynosi n = 0,7 mPa.s. W przypadku komory przepływowej z filtrem z płytą równoległą szerokość (szer.) wynosi 4 mm, a głębokość (wys.) 0,133 mm. Głębokość komory może się nieznacznie różnić ze względu na różnice w grubości zastosowanej uszczelki Parafilm. W przypadku mikroszkiełek Ibidi szerokość wynosi 3,8 mm, a głębokość 0,4 mm.
    nuta: Ze względu na różnice w wymiarach kanału przepływu i dynamice wychwytywania stosujemy różne naprężenia ścinające dla modelu mikrosuwaka w porównaniu z modelem filtra.

5. Ustawianie równoległej komory przepływu płytowego z filtrami

1. Wytnij kawałek Parafilmu (tego samego rozmiaru co szklane szkiełko nakrywkowe) za pomocą metalowego szablonu. Wytnij szczelinę o wymiarach 20 x 4 mm w Parafilmie (aby utworzyć kanał przepływowy) za pomocą metalowego szablonu. Użyj uszczelki, aby zaznaczyć kanał przepływu na szklanym szkiełku nakrywkowym.
2. Dopasuj krawędzie 6-dołkowego filtra do szklanego szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że filtr zakrywa oznaczenia kanału przepływowego. Ostrożnie wytnij filtr za pomocą skalpela typu 10A.
3. Ostrożnie przykryj filtr uszczelką Parafilm, upewniając się, że szczelina kanału przepływu znajduje się pośrodku filtra (Rysunek 1D). Użyj kawałka czystej chusteczki i wypchnij wszelkie bąbelki.
4. Umieść szkiełko nakrywkowe we wgłębieniu dolnej płyty komory przepływowej z pleksiglasu. Umieść górną płytkę z pleksiglasu na górze uszczelki i skręć płytki ze sobą (Rysunek 1D).
5. Przekręć kran 3-kierunkowy, aby umożliwić przepływ buforu płuczącego (PBSA) przez zawór. Podłącz rurkę manometru do portu wlotowego górnej płyty pleksiglasowej. Przeprowadź PBSA przez kanał przepływowy, aby umożliwić przejście pęcherzyków.
6. Podłącz rurkę manometru z pompy strzykawkowej do portu wylotowego płytki z pleksiglasu. Ustawić pompę strzykawkową na napełnienie i nacisnąć przycisk uruchom. Wyczyść wszystkie PBSA, które kapały na górną płytę komory.
7. Umieść komorę na stoliku mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym. Dostosuj ostrość, aby wyświetlić EC nad filtrami (Rysunek 1B).

6. Perfuzja leukocytów nad komórkami śródbłonka

1. Wsypać 2 ml oczyszczonych neutrofili do zbiornika na próbkę i pozostawić do ogrzania na 2 minuty. Przemyć śródbłonek PBSA przez 2 minuty.
2. Przekręć zawór, aby perfuzjonować neutrofile nad śródbłonkiem. Dostarczyć bolus granulochłonny przez 4 minuty. Wyłącz zawór i wylej PBSA ze zbiornika do płukania przez pozostałą część eksperymentu.
3. Upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie przechodzą przez kanał przepływowy w żadnym momencie podczas testu, ponieważ spowoduje to zakłócenie monowarstwy EC i spowoduje oderwanie przylegających neutrofili.

7. Rejestrowanie wychwytywania i zachowania neutrofili

1. Rejestruj rekrutację neutrofili podczas przepływu neutrofili lub po perfuzji.
2. Wykonaj wszystkie nagrania cyfrowe z co najmniej 5 - 10 pól w środku kanału przepływowego. Zidentyfikuj środek kanału, przesuwając cel na krawędź kanału w porcie wlotowym i identyfikując środek portu.
   1. W przypadku nagrywania podczas przepływu neutrofili, rób zdjęcia pojedynczego pola co 10 sekund przez 1 minutę. Poruszaj się wzdłuż kanału i nagrywaj kolejne pole przez 1 minutę. Powtarzać tę czynność przez cały czas trwania bolusa.
   2. Aby zarejestrować postperfuzję, wykonaj 10-sekundowe nagrania 5-10 pól w dół środka kanału przepływowego w celu oceny zachowania leukocytów (zwykle 2 minuty po zakończeniu bolusa neutrofilowego). Rób zdjęcia co sekundę w 10-sekundowym interwale. Daje to wystarczająco dużo czasu na wychwycenie z przepływu i analizę zachowania przylegających neutrofili.
   3. Rejestruj pojedyncze pole zawierające co najmniej 10 transmigrujących neutrofili przez 5 minut, wykonując zdjęcia co 30 sekund. Można to wykorzystać do obliczenia prędkości migrowanych komórek (powyżej lub pod śródbłonkiem).
   4. Nagraj kolejną serię 10-sekundowych pól (zwykle 9 minut po perfuzji). Dzięki temu neutrofile mają czas na migrację przez monowarstwę śródbłonka.
   5. Zatrzymać pompę strzykawkową i wyjąć rurkę. Zdemontuj komorę przepływową i przepłucz zbiornik na próbkę oraz przewody. Powtórz dla kolejnych filtrów/kanałów mikroszkiełkowych.

8. Analiza rekrutacji i zachowania leukocytów

1. Policz liczbę neutrofili w każdym polu podczas 10-sekundowych nagrań w 2-minutowym punkcie czasowym. Aby zostały policzone, wszystkie komórki muszą znajdować się w polu pierwsze-drugie. Komórki, które znajdują się częściowo w polu po 2 stronach (np. górna/prawa granica) pola widzenia, są uwzględniane w zliczaniach, o ile pozostają w polu przez pełne 10 sekund.
2. Obliczyć średnią liczbę przylegających neutrofili na pole. Zmierz długość i szerokość rejestrowanego pola. Oblicz powierzchnię pola. Oblicz, ile pól znajduje się w 1 mm². Pomnóż średnią liczbę neutrofili przez liczbę pól w 1 mm².
3. Obliczyć całkowitą liczbę perfuzji neutrofili, mnożąc ilość perfuzji neutrofili (np. 2 x 10⁶/ml*Q [np. 0,0999 ml/min dla komory z przepływem na płytkach równoległych]) przez czas trwania bolusa (np. 4 min).
4. Podziel liczbę neutrofili/mm² przez całkowitą liczbę perfuzji neutrofili, aby określić całkowitą liczbę komórek, które uległy przyłączenia (komórki przylegające/mm² / 10⁶ perfundowane).
5. Oceń, czy przylegające neutrofile toczą się, mocno przylegają czy są transmigrowane.
   1. Toczący się neutrofil ma jasną fazę i powoli przemieszcza się wzdłuż monowarstwy śródbłonka (1 - 10 μm/s).
   2. Mocno przylegające komórki są jasne fazowo i związane z powierzchnią EC, albo pozostają nieruchome (tj. nie poruszają się podczas rejestracji), albo uległy zmianie kształtu i migrują po powierzchni EC (Rysunek 1Ei).
   3. Transmigrujący neutrofile są ciemne w fazie i znajdują się poniżej warstwy EC (ryc. 1Eii).
6. Oblicz procent przylegających komórek, które są toczące się, nieruchome i transmigrowane. Alternatywnie, zachowanie neutrofili można wyrazić jako całkowitą liczbę komórek, które wykazują różne zachowania, stosując ten sam wzór, który jest używany do obliczania całkowitej adhezji (jak opisano w krokach 8.6 - 8.7).
   1. Zaznacz krawędź czołową toczącego się neutrofilu. Zaznacz krawędź wiodącą tej samej komórki na końcu 10-sekundowej sekwencji. Narysuj linię między tymi 2 punktami i zmierz odległość, jaką przebyła komórka.
   2. Podziel tę wartość przez czas trwania nagrania, w którym toczy się komórka (tj. 10 sekund). Spróbuj wybrać neutrofile, które są w terenie przez cały 10-sekundowy interwał.
7. Aby obliczyć prędkość neutrofili migrujących nad powierzchnią (kształt, zmieniona faza, jasna) lub pod śródbłonkiem (ciemna faza), należy skorzystać z 5-minutowego zapisu.
   1. Narysuj kontur migrowanych komórek na początku sekwencji i śledź ich ruchy w całej sekwencji. Zanotuj pozycje X i Y środka ciężkości w każdym 1-minutowym interwale dla każdej komórki. Odejmij wartości pozycji X i Y od pierwszego obrazu sekwencji od wartości na drugim obrazie. Opiera się to na twierdzeniu Pitagorasa.
   2. Odejmij wartości od drugiego obrazu od trzeciego obrazu. Zrób to dla wszystkich obrazów w sekwencji. Podnieś wartości X i Y do kwadratu i dodaj je do siebie.
   3. Pierwiastek kwadratowy z wynikowej wartości. Oblicz prędkość dla każdej komórki, uśredniając prędkości obliczone dla każdego interwału minutowego. Śledź 10 migrujących neutrofili i oblicz średnią prędkość.

Wyniki

Rysunek 1. Ustanowienie wspólnej hodowli EC-MSC i analiza rekrutacji neutrofili przy użyciu testu adhezji opartego na przepływie. (A) Mikrofotografia (i) pierwotnego EC i (ii) pasażu 3 BMMSC wyhodowanego na kolbach do hodowli tkankowych. (B) Mikrofotografia EC i MSC hodowanych na 6-dołkowych wkładkach filtracyjnych Transwell. (C) Sc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagenaza typu Ia	Sigma	Zobacz materiał C2674	Rozcieńczyć w 10 ml PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg / ml. Przechowywać w temperaturze -20°C w podwielokrotnościach 1 ml.
PBS Dulbecco	Sigma	Zobacz materiał D8662	Z chlorkiem wapnia i magnezu. Przechowywać w sterylnym miejscu i przechowywać w temperaturze pokojowej.
1X Średni M199	Gibco (firma Gibco)	31150-022	Przed użyciem podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
Siarczan gentamycyny	Sigma	Zobacz materiał G1397	Przechowywać w temperaturze 4°C. Dodać do butelki M199 o pojemności 500 ml.
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu	Sigma	Numer katalogowy E9644	Przechowywać w temperaturze -20°C w 10 μl porcji.
Surowica cielęca płodu (FCS)	Sigma	Zobacz materiał F9665	FCS musi być testowany partiami, aby zapewnić wzrost i żywotność wyizolowanego EC. Podgrzewać w temperaturze 56°C. Przechowywać w 10 ml porcji w temperaturze -20°C.
Amfoterycyna B	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15290-026	Silny i staje się toksyczny w ciągu tygodnia, dlatego co tydzień należy przygotowywać świeżą, kompletną pożywkę HUVEC. Przechowywać w temperaturze -20°C w porcjach 1 ml.
Hydrokortyzon	Sigma	H0135	Zapas jest w etanolu. Przechowywać w temperaturze -20°C w 10 μl porcji.
Kolagenaza typu II	Sigma	Zobacz materiał C6885	Rozcieńczyć bulion w PBS do końcowego stężenia 100 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20°C w 100 μl podwielokrotności.
Hialuronidazy	Sigma	Zobacz materiał H3631	Rozcieńczyć materiał w PBS do końcowego stężenia 20 000 U/ml. Przechowywać w temperaturze -20°C w 100 μl porcji.
Sitko komórkowe 100 μm do probówki o pojemności 50 ml	Materiały do laboratoriów naukowych (SLS)	Numer telefonu 352360	Można również stosować inne dostępne na rynku sitka komórkowe (np. Greiner bio-one).
DMEM niski poziom glukozy	Surowice biologiczne	LM-D1102/500	Przed użyciem podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
Mieszanina penicyliny/streptomycyny	Sigma	Zobacz materiał P4333	Przechowywać w temperaturze -20°C w porcjach 1 ml.
25cm2 kolba do hodowli tkankowych	Sls	353109
75cm2 kolba do hodowli tkankowych	Sls	353136
Fiolka mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego	Lonza	Zobacz materiał PT-2501	Po przybyciu przechowywać w ciekłym azocie. Komórki znajdują się w przejściu 2 po przybyciu, ale są oznaczone jako przejście 0. Pobrać do przejścia 3 i przechowywać w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania.
Pożywka dla wzrostu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCGM)	Lonza	Zobacz materiał PT-3001	Przed użyciem podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Do barwienia Cell Tracker Green użyj podłoża bez FCS.
Roztwór EDTA (0,02%)	Sigma	E8008	Przechowywać w temperaturze 4°C. Przed użyciem ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
Roztwór trypsyny	Sigma	Zobacz materiał T4424	Przechowywać w temperaturze -20°C w porcjach 2 ml. Rozmrozić w temperaturze pokojowej i natychmiast zużyć.
Kriofiale	Greiner bio-one	2019-02	Przechowywać na lodzie przed dodaniem przed dodaniem zawiesiny komórek.
Pojemnik do zamrażania Mr. Frosty	Nalgene powiedział:	5100-0001	Przechowywać w temperaturze pokojowej. Podczas dodawania kriowiali z komórkami przechowywać w temperaturze -80°C przez 24 godziny przed przekształceniem komórek do ciekłego azotu.
Zielony barwnik do śledzenia komórek	Technologie życiowe	Zobacz materiał C2925	Przechowywać w porcjach 5 μl w temperaturze -20°C. Rozcieńczyć w 5 ml podgrzanego (w 37°C) MSCGM.
Komory do liczenia komórek	Nexcelom	SD-100	Alternatywnie można użyć hemocytometru.
Automatyczny licznik komórek T4	Nexcelom	Automatyczny T4-203-0238
Czynnik martwicy nowotworu α (TNFα)	Systemy badawczo-rozwojowe	210-TA-100	Rozcieńczyć materiał w PBS do końcowego stężenia 100 000 U/ml. Przechowywać w temperaturze -80°C w podwielokrotnościach 10 μl.
6-dołkowe, 0,4 μm filtry PET Transwell	Sls	Numer katalogowy: 353090
K2-EDTA w probówkach o pojemności 10 ml	Sarstedt		Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Histopaque 1119	Sigma	Numer katalogowy: 11191	Przechowywać w temperaturze 4°C. Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej.
Histopaque 1077	Sigma	Numer katalogowy: 10771	Przechowywać w temperaturze 4°C. Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej.
10 ml probówka z okrągłym dnem	Lasy Appleton	SC211 142 JAKO
7,5% roztwór BSA frakcji V	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 15260-037	Przechowywać w temperaturze 4°C.
Strzykawki Plastipak 20 ml	Sokół BD	300613
Strzykawki Plastipak 5 ml	Sokół BD	302187
Strzykawki Plastipak o pojemności 2 ml	Sokół BD	300185
Hipoalergiczna taśma chirurgiczna 3M 9m x 2,5cm	Mikropory	1530-1	Służy do przymocowania kranu strzykawki do ściany komory z pleksiglasu.
Rurka z kauczuku silikonowego, średnica wewnętrzna/średnica zewnętrzna (ID/OD) 1/3mm (cienkie rurki)	Fisher Naukowy	FB68854	Przytnij rurki silikonowe do odpowiedniego rozmiaru. Wszystkie rurki prowadzące bezpośrednio do mikrozaworu elektronicznego muszą być cienkie.
Rurka z gumy silikonowej ID/OD: 2/4 mm (gruba rurka)	Fisher Naukowy	FB68855
Rurki manometru Portex Blue Line	Smiths	200/495/200	Rurka prowadząca do pompy strzykawkowej.
Kran 3-drogowy	BOC Ohmeda AB
Szklana strzykawka 50ml do pompki	Popper Micromate	550962	Przed użyciem należy go zagruntować, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza.
Szkiełko nakrywkowe szklane	Rajmund Baranek		Szkiełka nakrywkowe 26x76mm wykonywane na zamówienie. Numer partii 2440980.
Uszczelka parafilmowa	Amerykańska narodowa firma produkująca puszki		Wytnij kawałek parafilmu o wymiarach 26x76mm za pomocą aluminiowego szablonu i wytnij w nim szczelinę 20x4mm za pomocą skalpela 10a. Grubość uszczelki wynosi około 133μm.
Dwie równoległe płyty z pleksiglasu	Laboratorium Technologii Stosowanych Wolfson		Specjalnie zaprojektowana komora składająca się z równoległych płyt połączonych ze sobą za pomocą 8. Dolna płyta ma wyciętą pośrodku szczelinę obserwacyjną oraz płytkie wgłębienie wyfrezowane tak, aby zapewnić miejsce na szkiełko nakrywkowe, filtr i uszczelkę. Górna płyta z pleksiglasu ma otwór wlotowy i wylotowy umieszczony nad kanałem przepływowym.
Elektroniczny mikrozawór 3-drogowy z min. martwą przestrzenią	Lee Products Sp. z o.o.	LFYA1226032H	Elektronicznie podłączony do zasilacza 12 V DC.
Pompa strzykawkowa do infuzji/pobierania (PHD2000)	Aparatura Harvarda	70-2001	Ustaw średnicę na 29 mm i szybkość napełniania (przepływu).
Łącznik w kształcie litery L	Labhut	LE876	Do przymocowania do portów wlotowych i wylotowych na kanale mikrosuwakowym Ibidi.
Kamera wideo	Obrazowanie Q	01-QIC-F-M-12-C	Podłączony do komputera, który umożliwia nagrywanie cyfrowych filmów.
Image-Pro Plus 7.0	Cybernetyka mediów	Numer katalogowy: 41N70000-61592	Do analizy danych. Ręcznie oznacz komórki, wyświetlając różne zachowania. Śledź komórki do analizy prędkości toczenia i migracji.

powiedział: powiedział: powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: