$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Indukcja starzenia się przez leki chemioterapeutyczne w hodowanych komórkach nowotworowych
UWAGA: Wszystkie kroki manipulacji komórkami w tej sekcji powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu sterylnych praktyk. Ta sekcja jest napisana dla przylegających typów komórek. Ogniwa zawiesinowe mogą być używane z odpowiednimi modyfikacjami, jak wspomniano.
- Hoduj linię(-y) komórek rakowych zgodnie ze standardowym protokołem dostawcy lub laboratorium, które dostarczyło konkretną użytą linię (linie) komórkową.
nuta: Komórki o niskim pasażu (p < 10) są ogólnie preferowane, ponieważ w próbkach komórek niepoddanych działaniu substancji będą niższe poziomy starzenia replikacyjnego, tj. niższe tło.
- Na dzień przed indukcją starzenia przez leki należy pobrać komórki z trypsyną-EDTA 0,25% (lub zgodnie z zaleceniami). Zneutralizować trypsynę, dodając równą objętość kompletnej pożywki hodowlanej i przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej stożkowej probówki.
nuta: Ten krok nie jest potrzebny w przypadku komórek zawiesinowych.
- Policz komórki za pomocą standardowej metody hemacytometru i zapisz komórki/ml. Płytki po 1 × 10 3-10 × 103 komórki/cm2 w standardowych 6-dołkowych plastikowych naczyniach hodowlanych.
nuta: Optymalna gęstość posiewu zależy od szybkości proliferacji komórek i powinna być określana przez użytkownika. Komórki powinny znajdować się w fazie logarytmicznej wzrostu przy około 10%-20% zbiegu w czasie leczenia (tj. po 18-24 godzinach inkubacji po posiewie). Gęstość początkowa (komórki/ml) komórek zawiesiny powinna być określona przez użytkownika. Płytki sześciodołkowe zazwyczaj dają wystarczającą ilość komórek starczych na studzienkę na jedną standardową próbkę do analizy cytometrii przepływowej. W przypadku sortowania przepływowego należy użyć znacznie większej powierzchni (np. wielu płytek P150), aby umożliwić odzyskanie wystarczającej liczby komórek starczych do dalszych testów (≥1 × 106).
- Inkubować posiane komórki przez noc (18-24 godziny) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i szalką do pomiaru wilgotności.
- Potraktuj posiałe komórki lekami chemioterapeutycznymi wywołującymi starzenie. Obejmują co najmniej jedną kontrolę dodatnią, np. etopozyd (ETO) lub bleomycynę (BLM). Przygotuj zduplikowane studzienki na lek. Dołącz jeden zestaw traktowany jako kontrola, gdy pojazd jest tylko w pojeździe.
nuta: Użytkownik powinien przebadać krzywą dawkowania dla każdego czynnika doświadczalnego w celu określenia optymalnego stężenia dla indukcji starzenia się w używanej linii komórkowej (liniach komórkowych).
- Inkubować komórki przez 4 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością miski, aby umożliwić początek starzenia. Codziennie badaj pod kątem oczekiwanych zmian morfologicznych za pomocą mikroskopu świetlnego.
nuta: Czas inkubacji od 3 do 5 dni może być akceptowalny w zależności od tempa starzenia się. Pożywka może być zmieniana, a środek ponownie stosowany (lub nie), zgodnie z życzeniem, w celu promowania zdrowych warunków wzrostu przy jednoczesnym osiągnięciu akceptowalnego odsetka komórek starczych.
- Po rozpoczęciu starzenia się należy zebrać komórki, dodając trypsynę-EDTA 0,25% przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Gdy komórki są dysocjowane do zawiesiny, zneutralizuj trypsynę równą objętością kompletnej pożywki.
nuta: Ten krok nie jest potrzebny w przypadku komórek rosnących w zawiesinie. Jeśli będzie przeprowadzane barwienie markerami powierzchniowymi, unikaj stosowania trypsyny-EDTA, ponieważ może ona tymczasowo zniszczyć antygeny powierzchniowe na komórkach. Zamiast tego delikatnie zdysocjuj monowarstwę za pomocą sterylnego plastikowego skrobaka do komórek (lub alternatywnego odczynnika dysocjacyjnego zaprojektowanego w celu zachowania antygenów powierzchniowych).
- Policz komórki w każdej próbce za pomocą hemacytometru. Oblicz komórki/ml dla każdej próbki.
nuta: Błękit trypanowy można dodać w celu oceny procentu martwych komórek w tym momencie (tj. z powodu leczenia farmakologicznego), ale śmierć komórki zostanie również określona za pomocą barwnika fluorescencyjnego podczas procesu barwienia DDAOG.
- Podwielokrotność ≥0,5 × 106 komórek na próbkę do probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
nuta: Liczba komórek w próbce powinna być ustandaryzowana dla wszystkich próbek.
- Odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 1 000 × g w mikrowirówce w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
nuta: Jeśli mikrowirówka z chłodzeniem jest niedostępna, dopuszczalne może być przeprowadzenie wirowania w temperaturze otoczenia w przypadku niektórych odpornych typów komórek.
- Przejdź do barwienia DDAOG w sekcji 2.
2. Barwienie DDAOG SA-β-Gal w próbkach komórkowych
- Rozcieńczyć 1 mM bafilomycyny A1 w stosunku 1:1 000x w pożywce DMEM (bez FBS) do uzyskania końcowego stężenia 1 μM.
- Dodać przygotowany roztwór Baf-DMEM do próbek osadów komórkowych (z kroku 1.11) w stężeniu 1 × 106 komórek/ml.
nuta: Na przykład, jeśli używasz 0,5 × 106 komórek na próbkę, dodaj 0,5 ml Baf-DMEM.
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C (bez CO2 ) na rotatorze/wytrząsarce ustawionej na małą prędkość.
nuta: Unikaj inkubatorów CO2 w procesie barwienia, które mogą zakwaszać roztwory, a tym samym zakłócać barwienie Baf i DDAOG.
- Bez przemywania dodać roztwór podstawowy DDAOG (5 mg/ml) w proporcji 1:500x (10 μg/ml wersja ostateczna) do każdej próbki. Odpipetować do mieszania. Wymieniać na rotatorze/wytrząsarce w temperaturze 37 °C (bez CO2 ) przez 60 minut. Chronić przed bezpośrednim światłem.
- Odwirowywać probówki przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
- Przemyć 1 ml lodowatego 0,5% BSA na probówkę i odpipetować do wymieszania. Odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz ten krok 2x, aby dokładnie umyć komórki. Usunąć supernatant i kontynuować.
nuta: Ważne jest, aby wykonać kroki płukania opisane w kroku 2.6 w celu usunięcia nierozszczepionego DDAOG, który może wykazywać niepożądaną emisję fluorescencji (460/610 nm).
- (Opcjonalnie) Utrwalanie i przechowywanie komórek barwionych DDAOG do późniejszej analizy
- Do każdej umytej próbki dodać kroplami 0,5 ml lodowatego 4% paraformaldehydu. Odpipetować do mieszania.
- Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj komórki 2x 1 ml PBS.
- Próbki należy przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C przed analizą metodą cytometrii przepływowej.
nuta: W przypadku próbek stałych pomiń krok 2.8.
- Rozcieńczyć bulion Calcein Violet 450 AM (1 mM) w proporcji 1:1,000x do 1% BSA-PBS (1 μM final). Dodać 300 μl (dla próbek z hodowli komórkowych) do przemytych osadów komórkowych z kroku 2.6. Inkubować przez 15 minut na lodzie w ciemności.
- Przejdź do ustawień cytometrii przepływowej (sekcja 3).
3. Konfiguracja cytometru przepływowego i akwizycja danych
- Przenieść próbki komórek do probówek kompatybilnych z przyrządem do cytometrii przepływowej. Umieść probówki na lodzie i chroń je przed światłem.
nuta: Jeżeli w zawiesinach komórek obserwuje się agregaty, przed analizą przepuść zawiesinę przez sitka do komórek o wielkości 70-100 μm. Nie używaj filtrów siatkowych 40 μm, ponieważ mogą one wykluczyć niektóre z większych komórek starczych.
- W oprogramowaniu, do którego się odwołuje (patrz Tabela materiałów), otwórz następujące wykresy: 1) wykres punktowy FSC-A vs SSC-A, 2) histogram kanału fioletowego, 3) kanał dalekiego czerwonego (np. APC-A) kontra kanał zielony (np. FITC-A) wykres punktowy.
nuta: Można również stosować wykresy wykluczenia dubletów i histogramy jednokanałowe, ale nie są one bezwzględnie wymagane.
- Zainicjuj akwizycję danych cytometru.
- Umieścić próbkę kontrolną znajdującą się wyłącznie w pojeździe zabarwioną DDAOG w porcie wlotowym. Przy niskiej prędkości pobierania rozpocznij pobieranie danych próbki.
- Dostosuj napięcia FSC i SSC tak, aby >90% zdarzeń znajdowało się na wykresie. Jeśli komórki nie mieszczą się dobrze na wykresie, zmniejsz ustawienie skalowania obszaru do 0,33–0,5 jednostki.
- Usunąć próbkę znajdującą się wyłącznie w pojeździe bez rejestrowania danych.
- (Opcjonalnie) Dodaj jedną kroplę tęczowych mikrosfer kalibracyjnych do probówki cytometru z 1 ml PBS. Umieść rurkę w porcie wlotowym cytometru. Rozpocznij pobieranie przykładowych danych.
- Dostosuj napięcia kanału fioletowego, zielonego i dalekiego czerwonego tak, aby górny pik tęczowej mikrosfery mieścił się w zakresie 104-105 jednostek względnej fluorescencji w każdym kanale, a wszystkie piki były dobrze oddzielone w każdym kanale. Rekord 10 000 wydarzeń. Wyjmij rurkę.
- Umieścić dodatnią próbkę kontrolną (np. BLM, ETO) zabarwioną DDAOG w porcie wlotowym. Przy niskiej prędkości uzyskaj przykładowe dane. Obserwuj zdarzenia w kanałach FSC, SSC, fioletowym, zielonym i dalekim czerwonym, aby upewnić się, że ponad 90% zdarzeń jest zawartych na wszystkich wykresach. Zwróć uwagę na wzrost sygnału AF i DDAOG w porównaniu ze sterowaniem tylko pojazdem.
- Jeśli używasz cytometru sortującego, rozpocznij sortowanie na tym etapie.
- Do celów ewidencji należy zapisać 10 000 komórek dla próbki kontrolnej i każdej posortowanej próbki.
- Posortuj żądaną ilość komórek (zwykle odpowiednie jest ≥1 × 106) do odpowiedniej dla danego narzędzia probówki zbiorczej z 3-5 ml pożywki hodowlanej.
- Po sortowaniu przejdź do dalszej hodowli lub analizy.
nuta: W przypadku skalibrowanego cytometru przepływowego zastosowanego w niniejszym dokumencie optymalne napięcia kanału zwykle mieściły się w przedziale od 250 do 600 (średni zakres), ale optymalne napięcia i zakresy napięcia kanału będą się różnić w zależności od przyrządu. Unikaj używania voltage w bardzo niskich lub wysokich zakresach, które mogą tłumić sygnał lub wzmacniać szumy.
- Po wykonaniu kroków 3.1-3.5 i dokonaniu niezbędnych korekt ustawień cytometru, należy zapisać dane dla wszystkich próbek. Upewnij się, że ustawienia pozostają jednolite dla wszystkich nagrań próbki. Rejestruj ≥10 000 zdarzeń na próbkę hodowanej komórki.
nuta: Chociaż bramkowanie i analizę można przeprowadzić za pomocą oprogramowania do akwizycji danych (np. FACSDiva), kompletny przepływ pracy bramkowania i analizy, który należy przeprowadzić po akwizycji przy użyciu oddzielnego oprogramowania analitycznego (FlowJo), opisano w sekcji 4 poniżej. Preferowana jest analiza po akwizycji w celu skrócenia czasu pracy przy stacji roboczej cytometru i skorzystania z dodatkowych narzędzi zawartych w dedykowanym oprogramowaniu do analizy.
- Zapisz przykładowe dane w formacie pliku .fcs. Eksportuj pliki do komputera stacji roboczej wyposażonej w oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej (np. FlowJo).
4. Analiza danych cytometrii przepływowej
UWAGA: Prezentowany przepływ pracy korzysta z oprogramowania FlowJo. Alternatywne oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej może być stosowane, jeśli w podobny sposób przestrzegane są kluczowe kroki opisane w tej sekcji.
- Korzystając z oprogramowania FlowJo, otwórz pliki danych .fcs z kroku 3.7.
- Otwórz okno układu.
- Przeciągnij i upuść wszystkie próbki do okna układu.
- Bramka żywotnych komórek.
- Najpierw kliknij dwukrotnie przykładowe dane dla kontrolki tylko pojazdu, aby otworzyć jej okno danych.
- Wizualizuj dane jako histogram kanału fioletowego. Zidentyfikuj żywe komórki wybarwione przez CV450 na podstawie ich jaśniejszej fluorescencji niż martwe komórki.
- Narysuj bramkę za pomocą narzędzia histogramu pojedynczej bramki, aby uwzględnić tylko żywe komórki. Nazwij bramę żywotną.
- Następnie z okna układu próbki przeciągnij żywotną bramkę na inne próbki komórek, aby równomiernie zastosować bramkę.
- W oknie układu zwizualizuj wszystkie próbki jako histogramy kanału fioletowego (żywotności). Przed kontynuowaniem sprawdzić, czy bramkowanie żywotnych komórek jest odpowiednie dla wszystkich próbek; Jeśli nie, wprowadź odpowiednie poprawki.
nuta: Barwienie żywotności może wykazywać różnice w zależności od zabiegu.
- Brama komórek starczych.
- Kliknij dwukrotnie dane bramkowanej żywotnej komórki, aby wyświetlić element sterujący tylko pojazdem, aby otworzyć okno danych.
- Wizualizuj dane jako wykres punktowy dla kanału dalekiego czerwonego (DDAOG) i kanału zielonego (AF).
- Narysuj bramkę za pomocą narzędzia do bramkowania prostokąta, aby uwzględnić <5% komórek DDAOG+ i AF+ (prawy górny kwadrant). Nazwij bramę starczą.
- Następnie z okna układu próbki przeciągnij starczą bramkę na żywotne podzbiory innych próbek komórek, aby równomiernie zastosować bramkę.
- Do okna układu przeciągnij i upuść wszystkie żywotne podzbiory komórek bramkowane w sekcji 4.4. Wizualizuj wszystkie żywe próbki jako wykresy punktowe kanału dalekiego czerwonego (np. APC-A) i zielonego kanału (np. FITC-A).
- Upewnij się, że bramka starzenia narysowana w kroku 4.5.3 jest widoczna na wszystkich powierzchniach i że bramka do kontroli tylko dla pojazdu wykazuje ≤5%-10% komórek starczych.
- Po określeniu procentu komórek starczych przy użyciu powyższych kroków, przedstaw wynikowe dane za pomocą wykresów FlowJo, podsumowane w tabeli danych i/lub przeanalizowane statystycznie za pomocą standardowego oprogramowania.