$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie odczynników
- Podłoże z solami żółciowymi: Aby przygotować tryptyczny bulion sojowy (TSB) zawierający 0,4% soli żółciowych (wagowo/objętościowo), należy ponownie zawiesić 200 mg soli żółciowych w 50 ml autoklawizowanego TSB. Filtr sterylizuje za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotuj świeżą pożywkę co tydzień.
Notatki: Rutynowo stosowaną solą żółciową jest mieszanina cholanu sodu i deoksycholanu sodu w stosunku 1:1 wyizolowana z pęcherzyków żółciowych owiec i bydła. Jak wykazano wcześniej, obecność glukozy była niezbędna do tworzenia biofilmu indukowanego solami żółciowymi. TSB dodał glukozę w stosunku do bulionu Luria-Bertani (LB); a zatem był wystarczający do wywołania tworzenia biofilmu u Shigella i innych analizowanych patogenów jelitowych. W zależności od bakterii, które mają być analizowane, mogą być potrzebne różne stężenia glukozy lub różne wymagania dotyczące cukru.
- 0,5% w/v fioletu krystalicznego w wodzie: Rozpuść 2,5 g fioletu krystalicznego w 500 ml wody destylowanej. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.
2. Przygotowanie bakterii
- Hodować przez noc kultury szczepów bakteryjnych, które mają być testowane, zaszczepiając 3 ml TSB pojedynczą, dobrze izolowaną kolonią w sterylnej probówce hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min przez noc (16 - 24 h).
nuta: Szczepy powinny być ponownie wyjmowane z zamrażarek co 2 do 4 tygodni i utrzymywane na talerzach nie starszych niż 2 tygodnie.
3. Test zgodności w fazie stałej
UWAGA: Ten test określa ilościowo przylegające bakterie przy użyciu metody płytki 96-dołkowej. Bakterie są hodowane statycznie w płaskich płytach dennych. Mycie odbywa się w celu usunięcia nieprzywierających bakterii, a bakterie przylegające są barwione fioletem krystalicznym. Plama fioletu krystalicznego wiąże peptydoglikan w ścianie komórkowej bakterii i może być rozpuszczalna przy użyciu etanolu. Liczba bakterii adherentnych jest określana na podstawie retencji fioletu krystalicznego.
- Ustaw dwie probówki o pojemności 1,5 ml. Etykieta z TSB lub TSB + sole żółciowe (BS).
- Dodaj 1 ml TSB lub TSB + BS do odpowiednich probówek.
- Zaszczepić probówki 20 μl nocnej hodowli (w rozcieńczeniu 1:50).
- Na sterylnej, przezroczystej, płaskodennej, 96-dołkowej płytce poddanej kulturze tkankowej dodać 130 μl / basenik niezaszczepionej pożywki kontrolnej do trzech dołków, aby służyły jako ślepa kontrola. Ustaw trzy studzienki kontrolne dla każdego typu nośnika (TSB i TSB + BS), który ma być testowany.
- Dodać 130 μl/basenik zaszczepionej kultury do trzech dołków i powtarzać, aż wszystkie warunki doświadczalne zostaną posiane w trzech egzemplarzach.
- Inkubować statycznie przez 4 - 24 godziny w temperaturze 37 °C.
- Za pomocą czytnika płytek zapisz OD600. Ustaw studzienki kontrolne jako "puste". Upewnij się, że pożywka kontrolna jest czysta i nie ma oznak zmętnienia. Jeśli zostanie wykryte jakiekolwiek zmętnienie, odrzuć eksperyment. Wartości OD600 mogą być wykorzystane do normalizacji danych, jeśli istnieją znaczące różnice w szybkości wzrostu między szczepami bakteryjnymi.
- Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą linii próżniowej, delikatnie przechylając płytkę i powoli zasysając pożywkę przy dolnej krawędzi studzienki. Pamiętaj, aby zebrać całą pożywkę hodowlaną bez zakłócania przylegającej populacji bakterii znajdujących się na plastikowej powierzchni. Jeśli zewnątrzkomórkowa matryca polisacharydowa (EPS) została wytworzona w czasie inkubacji, matryca zostanie uwidoczniona jako biały osad. Nie zakłócaj pracy matrycy EPS.
- Delikatnie umyj studzienki 200 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wyjmij mycie PBS za pomocą przewodu próżniowego.
- Odwróć płytkę do wyschnięcia. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 20 minut.
nuta: Ponieważ biofilm musi być dokładnie wysuszony przed barwieniem, protokół można wstrzymać na tym etapie na kilka godzin lub nawet na noc. Dodatkowy czas schnięcia nie zmieni procedury barwienia, podczas gdy niepełne suszenie wpłynie na kwantyfikację wyników i odtwarzalność.
- Dodaj 150 μl 0,5% fioletu krystalicznego do każdej studzienki doświadczalnej i kontrolnej.
- Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Umyj studzienki raz 400 μl wody destylowanej. Dodatkowa objętość pomaga usunąć resztkową plamę fioletu krystalicznego z boków studzienek. Usuń pranie za pomocą przewodu próżniowego.
- Umyj studzienki pięciokrotnie 200 μl wody destylowanej. Usuń pranie za pomocą przewodu próżniowego.
nuta: Dokładne mycie jest ważne dla oceny ilościowej. Gdy ślepe studzienki są czyste od wody destylowanej i nie zawierają żadnych pozostałości plamy fioletu krystalicznego, przejdź do następnego kroku.
- Odwróć płytkę do wyschnięcia, chroniąc przed światłem. Upewnij się, że płyta całkowicie wyschnie, jak wspomniano powyżej.
- Odbarwić studzienki 200 μl 95% etanolu. Inkubować płytkę na wytrząsarce przez 30 minut. Aby uniknąć parowania, szczególnie w wyższych temperaturach, wykonaj ten krok w temperaturze 4 °C.
- Za pomocą czytnika płytek zapisać gęstość optyczną na poziomie 540 (OD540).
nuta: Długość fali zapewniająca maksymalną absorbancję fioletu krystalicznego jest bliska 590 nm. W literaturze podaje się zakres od OD540 doOD 595 dla absorbancji fioletu krystalicznego; W ten sposób wybierz dostępną długość fali w oparciu o czytnik płytek.