1. Przygotowanie odczynników
- Podłoże z solami żółciowymi: Aby przygotować tryptyczny bulion sojowy (TSB) zawierający 0,4% soli żółciowych (wagowo/objętościowo), należy ponownie zawiesić 200 mg soli żółciowych w 50 ml autoklawizowanego TSB. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Zrób świeżą pożywkę co tydzień.
Notatki: Rutynowo stosowaną solą żółciową jest mieszanina cholanu sodu i deoksycholanu sodu w stosunku 1:1 wyizolowana z pęcherzyków żółciowych owiec i bydła. Jak wykazano wcześniej, obecność glukozy była niezbędna do tworzenia biofilmu indukowanego solami żółciowymi. TSB dodał glukozę w stosunku do bulionu Luria-Bertani (LB); a zatem był wystarczający do wywołania tworzenia biofilmu u Shigella i innych analizowanych patogenów jelitowych. W zależności od bakterii, które mają być analizowane, mogą być potrzebne różne stężenia glukozy lub różne wymagania dotyczące cukru.
- 0,5% w/v fioletu krystalicznego w wodzie: Rozpuść 2,5 g fioletu krystalicznego w 500 ml wody destylowanej. Filtr sterylizuje za pomocą filtra 0,22 μm.
- Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + glukoza: Rozpuść 0,2 g glukozy w 10 ml 1x PBS (2% w/v glukozy końcowej). Filtr sterylizuje za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotuj świeże w dniu użycia.
- PBS + sole żółciowe: Rozpuść 40 mg w 10 ml 1x PBS (0,4% w/v soli żółciowych końcowych). Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotuj świeże w dniu użycia.
- PBS + glukoza i sole żółciowe: Rozpuścić 40 mg soli żółciowych i 0,2 g glukozy w 10 ml 1x PBS (0,4% w/v soli żółciowych i 2% w/v glukozy końcowej). Filtr sterylizuje za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotuj świeże w dniu użycia.
- Przygotuj płytki agarowe LB.
2. Przygotowanie bakterii
- Hodować przez noc kultury szczepów bakteryjnych, które mają być testowane, zaszczepiając 3 ml TSB pojedynczą, dobrze izolowaną kolonią w sterylnej probówce hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min przez noc (16 - 24 h).
nuta: Szczepy powinny być ponownie wyjmowane z wywarów zamrażarskich co 2 do 4 tygodni i utrzymywane na talerzach nie starszych niż 2 tygodnie.
3. Test dyspersji
UWAGA: W tym teście wykrywa się demontaż biofilmu poprzez dyspersję bakteryjną. Tutaj tworzą się dojrzałe biofilmy, a następnie (zwykle następnego dnia) pożywki są zastępowane PBS lub uzupełnionym PBS. Składnik sklarowany nad osadem jest następnie oceniany w celu ilościowego określenia liczby bakterii, które oddzieliły się od biofilmu.
- Ustaw dwie probówki o pojemności 1,5 ml. Etykieta z TSB lub TSB + BS (sole żółciowe).
- Dodaj 1 ml TSB lub TSB + BS do odpowiednich probówek.
- Zaszczepić probówki 20 μl nocnej hodowli (w rozcieńczeniu 1:50).
- Na sterylnej, przezroczystej, płaskodennej, 96-dołkowej płytce poddanej kulturze tkankowej dodać 130 μl / basenik niezaszczepionej pożywki kontrolnej do trzech dołków, aby służyły jako ślepa kontrola. Skonfiguruj trzy studzienki kontrolne dla każdego typu nośnika, który ma być testowany.
- Dodać 130 μl/basenik zaszczepionej kultury do trzech dołków i powtarzać, aż wszystkie warunki doświadczalne zostaną posiane w trzech egzemplarzach.
- Inkubować płytkę statycznie przez 4-24 godziny w temperaturze 37 °C.
- Przed kontynuacją ogrzej PBS, PBS + glukoza, PBS + sole żółciowe i PBS + sole żółciowe + glukoza do 37 °C. Odczynniki te należy codziennie przygotowywać na świeżo.
- Za pomocą czytnika płytek zapisz gęstość optyczną, OD600. Ustaw studzienki kontrolne jako "puste". Upewnij się, że podłoże jest klarowne bez oznak zmętnienia. Jeśli zostanie wykryte jakiekolwiek zmętnienie, odrzuć eksperyment. Wartości OD600 mogą być wykorzystane do normalizacji danych, jeśli istnieją znaczące różnice w szybkości wzrostu między szczepami bakteryjnymi.
- Usunąć pożywkę hodowlaną za pomocą przewodu próżniowego. Pamiętaj, aby zebrać całą pożywkę hodowlaną bez zakłócania populacji przylegającej znajdującej się na plastikowej powierzchni.
- Delikatnie umyć studzienki dwukrotnie 200 μl/studzienkę sterylnego PBS. Wyjmij mycie PBS za pomocą przewodu próżniowego.
- Zastąp płukanie 130 μl/studzienką następujących składników w trzech studzienkach każdy: PBS, PBS + glukoza, PBS + sole żółciowe i PBS + sole żółciowe + glukoza. Odczynniki te muszą być wstępnie podgrzane do temperatury 37 °C.
- Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Ostrożnie wyjąć płytkę z inkubatora o temperaturze 37 °C. Przenieść supernatanty na świeżą, sterylną płytkę 96-dołkową.
- Używając 96-dołkowej płytki lub bloku rozcieńczającego, przygotować 10-krotne (1:10) seryjne rozcieńczenia supernatantu do sterylnego PBS.
nuta: Seria rozcieńczeń powinna wahać się od nierozcieńczonego do 10-6 w zależności od badanego szczepu bakteryjnego. Można przeprowadzić eksperymenty pilotażowe w celu określenia optymalnego zakresu rozcieńczania.
- Umieścić na agarze LB 5 μl każdego rozcieńczenia za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Policz kolonie następnego dnia i uwzględnij współczynnik rozcieńczenia przy określaniu jednostek tworzących kolonie regeneracyjne (CFU). Aby obliczyć procentową dyspersję w stosunku do kontroli 1x PBS (ustawionej na 100%), podziel CFU odzysku z każdego warunku leczenia przez CFU odzysku z próbki kontrolnej 1x PBS.
nuta: Można również użyć rutynowych płytek z pożywką dla interesującego szczepu bakteryjnego. Na przykład Shigella może być platerowana na czerwonych talerzach Kongo. Upewnij się, że płytki są suche, aby można było zastosować odpowiednie techniki powlekania punktowego.
