$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie in vitro biofilmu bakterii na kolonii grzybów
- Odwirować kulturę bakteryjną przy 5 000 x g przez 3 minuty i zawiesić osad w 25 ml sterylnego 0,1 M buforu fosforanu potasu (25 g/L KH2PO4 i 2,78 g/L K2HPO4, pH 5,8). Powtórz ten krok raz i dostosuj końcowe stężenie bakterii do10-9 komórek/ml z tym samym buforem.
- Napełnić mikropłytkę 6-dołkową 5 ml zawiesiny bakteryjnej (lub sterylnego 0,1 M buforu fosforanu potasu do kontroli ujemnej).
- Przetnij błonę celofanową kultury grzybów sterylną żyletką, aby uzyskać kwadraty celofanu z pojedynczą kolonią grzybów na każdej membranie. Ostrożnie usunąć celofanowe kwadraty zawierające strzępki ze stałego podłoża za pomocą kleszczy i przenieść kwadrat celofanu zawierającego strzępki do studzienki mikropłytki zawierającej zawiesinę bakteryjną.
- Delikatnie potrząśnij mikropłytką, gdy kolonie grzybów są nadal przyczepione do celofanu; następnie usuń arkusze celofanu, pozostawiając kolonie grzybów na płytce.
- Inkubować mikropłytkę z delikatnym mieszaniem (~60 obr./min) w temperaturze dostosowanej do badanych mikroorganizmów.
nuta: Czas inkubacji zależy od szybkości tworzenia się biofilmu i etapu, który ma być analizowany. W przypadku P. fluorescens BBc6/L. bicolor inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut, aby uzyskać biofilmy we wczesnym stadium i do 16 godzin, aby uzyskać dojrzałe biofilmy.
2. Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna Analiza powstawania biofilmu
- Przygotowanie próbki
- Aby usunąć bakterie planktonowe i bakterie elektrostatycznie przyczepione do strzępek, opłucz grzyba, przenosząc go na nową 6-dołkową mikropłytkę wypełnioną 5 ml mocnego roztworu soli (NaCl, 17 g/l); delikatnie wstrząsać przez 1 minutę.
- Przenieść grzyba na nową 6-dołkową mikropłytkę zawierającą 5 ml sterylnego 0,1 M buforu fosforanu potasu, delikatnie wstrząsnąć przez 2 minuty i przenieść grzyb do świeżego buforu fosforanu potasu.
- Wytnij część kolonii grzybów, która ma być zobrazowana, za pomocą skalpela, trzymając ją w buforze fosforanu potasu, tak aby uzyskany fragment zawierał około połowy kolonii grzybów.
- Aby zabarwić próbkę, należy przenieść ją na szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą zawierającą odpowiedni barwnik fluorescencyjny (w zależności od celu analizy) i inkubować ją w ciemności.
- Aby zobrazować sieć grzybów, użyj na przykład czerwieni kongijskiej (0,1% stężenie końcowe, 5 minut inkubacji), lektyny agglutyny z kiełków pszenicy (WGA) sprzężonej z Alexa Fluor 633 (stężenie końcowe 10 μg/ml, 10 min inkubacji) lub FUN1 (stężenie końcowe 10 μM, 10 min inkubacji).
- Jeśli używasz bakterii nieznakowanej fluorescencyjnie, przeciwdziałaj barwieniu komórek bakteryjnych za pomocą sondy fluorescencyjnej specyficznej dla DNA, spośród licznych dostępnych na rynku barwników DNA przenikających komórki. Na przykład użyj DAPI (stężenie końcowe 0,25 μg/ml, 10 minut inkubacji).
- Aby uwidocznić białka macierzy, użyj barwnika białkowego.
- Po barwieniu przepłukać próbkę, przenosząc ją do pokrywki szalki Petriego zawierającej 10 ml sterylnego 0,1 M fosforanu potasu i delikatnie wstrząsać przez 1 minutę.
- Zanurz szkiełko do połowy w pokrywie szalki Petriego i delikatnie doprowadź wyciętą sekcję do unoszenia się nad szkiełkiem. Następnie powoli wyjmij szkiełko z roztworu buforowego, pozwalając, aby próbka delikatnie osiadła na szkiełku.
nuta: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby postępować delikatnie, aby uniknąć zakłócenia biofilmu.
- Na koniec dodać do próbki 10 μl antyblakującego podłoża montażowego i przykryć je szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
nuta: Po przygotowaniu szkiełka należy przeprowadzić analizę mikroskopową tak szybko, jak to możliwe (nie dłużej niż 30 minut), aby uniknąć modyfikacji struktury biofilmu.