Analiza w czasie rzeczywistym migracji rezydentnych limfocytów T w różnych regionach guza przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Streszczenie

Źródło: Peranzoni, Elisa, et al. Obrazowanie ex vivo rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc przy użyciu mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film opisuje obrazowanie rezydentów infiltrujących nowotwór limfocytów T CD8 znakowanych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w ludzkich wycinkach guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Protokół

1. Barwienie immunologiczne rezydentnych limfocytów T CD8 i komórek nowotworowych

1. Rozcieńczyć przeciwciała (stężenie końcowe 10 μg/ml) i barwnik jądrowy (stężenie końcowe 1 μg/ml) w pożywce RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej.
   nuta: Użyj fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał anty-CD8 (mysia IgG, klon SK1) i anty-EpCAM (cząsteczka adhezyjna komórek nabłonka) (mysia IgG HEA-125) do znakowania odpowiednio limfocytów T CD8 i komórek nabłonka nowotworowego. Użyj fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała anty-CD90 / Thy1 (mysia IgG, klon 5E10) do znakowania fibroblastów i aktywowanych komórek śródbłonka. Użyj 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do znakowania jądra komórkowego z naruszoną błoną plazmatyczną w celu oceny żywotności tkanek.
2. Wyjmij płytki hodowlane z inkubatora i za pomocą pipety zassaj płyn z podkładek ze stali nierdzewnej. Nie wyjmuj pożywki o pojemności 1.1 ml RPMI-1640 umieszczonej pod wkładkami do hodowli komórkowych.
3. Nie dotykając plastra i używając końcówki pipety, dodaj 40 μl roztworu zawierającego przeciwciała na każdy plasterek guza.
4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby umożliwić barwienie przeciwciałami.
5. Za pomocą cienkich kleszczy zdejmij podkładki, wyjmij plastry i zanurz je na 10 s w podłożu RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej. Umieść plastry z powrotem na wkładkach do hodowli komórkowych i dodaj kroplę pożywki RPMI-1640 wolnej od czerwieni fenolowej na każdy pojedynczy plasterek. Utrzymywać płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Przejdź do obrazowania.

2. Obrazowanie i analiza migracji rezydentnych limfocytów T CD8 w obrębie wycinków ludzkiego guza płuc

UWAGA: Mikroskop konfokalny używany w tym protokole to pionowy wirujący dysk wyposażony w obiektyw z 25-krotnym zanurzeniem w wodzie (25x/0,95 N.A.).

1. Przygotowanie zestawu mikroskopu
   1. Ustaw temperaturę komory grzewczej mikroskopu na 37 °C na kilka godzin przed rozpoczęciem sesji obrazowania.
   2. Skonfiguruj system do ciągłej perfuzji wycinków guza za pomocą natlenionego (5% CO₂, 95% O₂) pożywki RPMI wolnej od czerwieni fenolowej (ryc. 1). Za pomocą pompy perystaltycznej wprowadzić media perfuzyjne do komory obrazowania i zassać roztwór do kolby do zbierania odpadów.
   3. Uruchom pompę perystaltyczną, aby natleniony roztwór mógł przejść przez rurki perfuzyjne.
2. Za pomocą cienkich kleszczyków wyjmij plasterek z płytki 6-dołkowej i przenieś go do plastikowego naczynia o średnicy 35 mm wypełnionego pożywką RPMI bez czerwieni fenolowej. Unieruchom plasterek za pomocą kotwy o średnicy 19,7 mm z gwintami w odstępach 2 mm. Umieść szalkę Petriego na stoliku do obrazowania mikroskopu. Podłącz końcówki wlotowe i wylotowe systemu perfuzyjnego. Włącz system perfuzyjny i ustaw natężenie przepływu pożywki na 0,8 ml/min.
3. Opuść obiektyw zanurzenia w wodzie do plasterka. Skoncentruj się na górnej części plastra w jasnym świetle polowym. Używając odpowiedniego światła fluorescencyjnego, wybierz obszar zainteresowania, który zawiera limfocyty T CD8, wyspy guzaowe (dodatnie dla EpCAM) i obszar zrębu (dodatni dla CD90). Sprawdź żywotność komórek w plastrze, oceniając barwienie DAPI na powierzchni cięcia i głębiej w tkance.
   UWAGA: Zdrowy plasterek zawiera tylko mniejszość komórek DAPI-dodatnich w odległości kilku mikronów od powierzchni cięcia.
4. Ustaw sesję obrazowania, wykonując następujące czynności.
   1. W zależności od intensywności sygnału fluorescencyjnego 3 fluoroforów, ustaw czas naświetlania w zakresie od 50 do 800 ms, a intensywność lasera w zakresie od 20 do 40%.
   2. Wybierz grubość stosu z do zobrazowania w obrębie wycinka guza.
      nuta: Uchwycono tu 10-12 płaszczyzn optycznych o łącznej głębokości 60-70 μm w wymiarze z.
   3. Wybierz pozycję początkową około 10 μm poniżej pierwszych oznaczonych komórek T CD8.
   4. Zdefiniuj odstęp czasu między każdym obrazem ze stosu z zakresu od 10 do 30 s oraz całkowity czas nagrywania od 10 do 30 minut.

Wyniki

Rysunek 1: Fotografie systemu perfuzyjnego. A) Roztwór RPMI bez czerwieni fenolowej jest wzbogacony w 5% CO₂, 95% O₂ . B) Roztwór jest następnie perfundowany przez pompę perystaltyczną. C) Roztwór RPMI dostaje się do naczynia hodowlanego przez wlot. Na wylocie roztwór jest zasysany przez pompę z komory do pojemnika na odpady. Należy pamiętać, że końcówka aspiracji jest ustawion...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pionowy mikroskop konfokalny	Księga Leica	Zaleca się stosowanie konfokalnego dysku wirującego
Oprogramowanie Imaris	Płaszczyzna bitowa		Oprogramowanie to służy do wizualizacji obrazów i śledzenia migracji limfocytów T
Cienkie kleszcze	Światowe instrumenty precyzyjne	Numer katalogowy: 14142
Wkładki hodowlane 30 mm	Milipory	PICM0RG50
Pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI), suplement GlutaMAX	Rybak termiczny	61870010	Kompletna pożywka RPMI jest wytwarzana przez dodanie 10% inaktywowanej termicznie surowicy cielęcej płodu oraz penicyliny/streptomycyny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Rybak termiczny	20012019
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)	Invitrogen	14170088
Niska temperatura żelowania Agaroza typu VII-A	Sigma-Aldrich	Certyfikat A0701
Nietoksyczny klej cyjanoakrylowy butylu, Vetbond	3 mln	Rok 1469
Kotwy Slice, średnica 19,7, gwint o rozstawie 2 mm	Instrumenty Warnera	64-1415
Podkładki ze stali nierdzewnej, średnica wewnętrzna 5 mm	Amazonka	B004K1FDGQ
Anty-CD8 sprzężony z BV605 (klon SK1)	BD Nauki biologiczne	565289
Anty-EpCAM sprzężony z FITC (klon HEA-125)	Miltenyi Biotec	130-098-113
Anty-CD90 sprzężony z BV510 (klon 5E10)	Legenda biologiczna	328125
4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI	Rybak termiczny	Zobacz materiał D1306