UWAGA: Ten protokół kładzie nacisk na użycie cytometrii przepływowej FRET do wykrywania aktywności siewnej z próbek biologicznych myszy. Jest również kompatybilny z rekombinowanymi włókienkami i ludzkimi próbkami biologicznymi. Eutanazja myszy i pobieranie próbek mózgów przeprowadzono zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez IACUC.
1. Ekstrakcja mózgu
- Po głębokim znieczuleniu izofluranem (2%) należy przeprowadzić fuzję myszy za pomocą lodowatego PBS zawierającego 0,03% heparyny i wyekstrahować mózg zgodnie ze szczegółami opisanymi w Gage i wsp.
- Umieść wyekstrahowaną tkankę w kriofiolce i błyskawicznie zamroź, umieszczając w ciekłym azocie. Alternatywnie zamroź tkankę na suchym lodzie. Po zamrożeniu przenieść tkankę do temperatury -80 °C i przechowywać przez dłuższy czas, jeśli to konieczne.
nuta: Protokół ten jest kompatybilny z homogenatami całego mózgu lub mikropreparowanymi obszarami mózgu. Patrz Hagihara i wsp.w celu uzyskania szczegółowego protokołu mikropreparacji.
2. Przygotowanie biologicznego materiału siewnego
- Przygotować bufor homogenizacyjny, rozpuszczając inhibitory proteazy (wolne od kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)) w 1x TBS (sól fizjologiczna buforowana trisem, 1 tabletka na 10 ml). Energicznie wirować i przechowywać na lodzie. Inhibitory proteazy muszą być wolne od EDTA, aby zachować żywotność komórek biosensorów.
- Zważ zamrożoną tkankę mózgową w jednorazowej łódce do ważenia i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 5 ml. Dodać lodowaty bufor homogenizacyjny tak, aby końcowy roztwór miał 10% masy/objętości. Tymczasowo przechowywać na lodzie. Masa tkankowa i późniejsza objętość buforu homogenizacyjnego będą się różnić w zależności od wielkości mózgu i/lub użytych regionów. W tym przypadku dorosły półmózg myszy o wadze 0,2 g jest zawieszony w 2 ml w celu uzyskania 10% w/vol roztworu.
- Przenieś próbki do chłodni i dostosuj sonograf sondy do odpowiednich ustawień. W przypadku sonizacji sondy za pomocą Omni Ruptor (pokazanego tutaj), ustaw moc na 20%, co odpowiada około 75 W. Użyj trybu pulsacyjnego, aby upewnić się, że próbki nie są nadmiernie przegrzane podczas sonikacji. Ustaw impulser na 30%, co odpowiada około 500 ms.
- Oczyść końcówkę sonikatora sondy, spłukując ją wodą, izopropanolem i ponownie wodą, wycierając sondę pomiędzy każdym roztworem. Pamiętaj, aby wypłukać i wytrzeć zarówno boki, jak i spód sondy chusteczkami laboratoryjnymi.
- Pracując z jedną próbką na raz, zanurz końcówkę sondy w buforze homogenizacyjnym i uruchom sonikatór. Korzystając z opisanych powyżej ustawień mocy i pulsera, dostarcz łącznie 25 impulsów. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie w zawiesinie. Na tym etapie należy uważać, aby uniknąć spienienia próbki.
nuta: Próbki są podatne na pienienie, jeśli a) całkowita objętość jest mała lub b) homogenat się nagrzewa. Za pomocą tego konkretnego przyrządu nie należy wykonywać sonikacji o objętościach mniejszych niż 250 μl. Aby zapewnić schłodzenie próbek, na tym etapie probówki mogą być przechowywane na lodzie.
- Wyczyść sondę, wycierając resztki lizatu, a następnie wprowadź 10 impulsów do zlewki z czystą wodą. Opłucz boki i spód sondy wodą, izopropanolem i ponownie wodą (jak w kroku 2.4), wycierając do sucha między każdym krokiem. Aby uniknąć zanieczyszczenia, dokładnie przepłucz sondę między próbkami.
nuta: W przypadku kruszyw tau nie stwierdziliśmy, aby konieczne były bardziej rygorystyczne metody czyszczenia, aby zapobiec zanieczyszczeniu między próbkami. Inne amyloidy mogą jednak wymagać dodatkowej opieki, która została obszernie opisana w literaturze.
- Przechowywać homogenaty na lodzie do czasu, aż wszystkie próbki zostaną przetworzone.
- Wirować homogenaty w temperaturze 21 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Przenieść supernatant do czystej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu. Wyrzuć granulkę. Podzielić supernatant na porcje i przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania. Należy jednak unikać cykli zamrażania/rozmrażania homogenatów, ponieważ zmniejsza to wydajność wysiewu.
3. Ponowne tworzenie komórek biosensora
UWAGA: Użyj czterech linii komórkowych do tego testu: HEK 293T (linia komórkowa #1), RD-P301S-CFP (linia komórkowa #2), RD-P301S-YFP (linia komórkowa #3) i RD-P301S-CFP/YFP (linia komórkowa #4). Proszę zapoznać się z tabelą referencyjną 1, aby zapoznać się z wkładem każdej linii komórkowej w teście.
- W sterylnym środowisku odessać pożywkę hodowlaną. Przepłukać komórki ciepłym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i aspiratować. Trypsynizować komórki (3 ml trypsyny-EDTA (0,05%)) przez 3 minuty, wygaszać ciepłą pożywką hodowlaną (9 ml DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny, 1% GlutaMax) i natychmiast przenieść komórki do stożkowej probówki.
- Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w ciepłym pożywce hodowlanej.
- Za pomocą hemocytometru określ gęstość komórek dla każdej linii komórkowej. Gęstość komórek będzie się różnić w zależności od konfluencji w czasie zbioru i objętości ponownego zawieszenia. Ponownie zawiesić komórki zebrane z 10-centymetrowego naczynia przy 90% zbiegu w pożywce o objętości 10 ml, aby gęstość komórek wynosiła około 1 miliona komórek/ml.
- Wykonaj główną mieszankę komórek + pożywki w taki sposób, aby każda studzienka na płytce 96-dołkowej zawierała 35 000 komórek w pożywce 130 μl (np. Aby uzyskać mieszankę wzorcową na 100 dołków, ponownie zawieś 3,5 miliona komórek w pożywce 13 ml). Zmodyfikuj numer komórki, aby dopasować go do indywidualnych projektów eksperymentalnych i osi czasu. W przypadku leczenia komórek ~ 18 godzin po posianiu dodaj 35 000 komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki.
- Używając pipety wielokanałowej, powoli odpipetować 130 μl zawiesiny komórek mieszania głównego do każdego dołka na płaskiej dnie, 96-dołkowej płytki poddanej kulturze tkankowej. Podczas powlekania umieść końcówkę pipety na środku dołka, nie dotykając dna płytki.
nuta: Chociaż format posiewu można modyfikować, zaleca się wykonanie n = 4 dołków dla każdej linii komórkowej 1-3 na płytkę. Pozostała część płytki (n = 84) jest zarezerwowana dla linii komórkowej #4 (komórki biosensora).
- Pozwól komórkom osiąść, pozostawiając płytkę w spokoju przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności względnej ≥80%.
4. Leczenie komórek
UWAGA: Następnego dnia, gdy komórki biosensora tau są w 60-65% zlewne, przygotuj kompleksy transdukcji nasion w następujący sposób:
- W jednej probówce połącz odczynnik do transfekcji, taki jak Lipofectamina, z pożywką o zredukowanej surowicy, taką jak Opti-MEM, aby uzyskać mieszankę wzorcową. Do każdego dołka dodać 1,25 μl odczynnika do transfekcji i 8,75 μl pożywki o zredukowanej surowicy. Delikatnie przesuń rurkę, aby wymieszać, krótko odwiruj i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- W innej probówce połączyć materiał siewny (podwielokrotność lizatu z kroku 2.9) z pożywką o zredukowanej surowicy.
nuta: Objętość materiału siewnego będzie się różnić w zależności od indywidualnego eksperymentu. Wybierając objętość nasion, należy wziąć pod uwagę: obfitość nasion w próbce i potencjalną toksyczność. Surowe homogenaty mogą być toksyczne dla komórek. W związku z tym użyj najniższej możliwej głośności, aby monitorować pożądany efekt. Wcześniej badane objętości lizatu/studzienki wahają się od 1-5 μl, co odpowiada 5-20 μg białka całkowitego. Upewnij się, że całkowita objętość na studzienkę (nasiona + pożywka o obniżonej surowicy) wynosi 10 μl.
- Połączyć zawartość z dwóch probówek opisanych w ppkt 4.1 i 4.2, delikatnie strzepnąć do wymieszania, krótko odwirować (1 000 x g, 5 s) i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut i do 2 godzin.
- Delikatnie odpipetować 20 μl kompleksu transdukcyjnego na boku poszczególnych studzienek biosensora. Jeśli to możliwe, należy użyć trzech powtórzeń technicznych. Umieść potraktowane komórki z powrotem w inkubatorze na 24-48 godzin. Inkubować w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 3.6.
nuta: Odpowiednim warunkiem kontroli ujemnej dla tej konfiguracji są komórki biosensorów potraktowane pustymi liposomami (tj. odczynnikiem liposomowym + pożywką o zmniejszonej surowicy), ponieważ zastosowanie fosfolipidów wprowadza niewielkie przesunięcie profilu fluorescencji w stosunku do komórek biosensorów niewystawionych na działanie odczynnika liposomowego.
5. Pobieranie komórek do cytometrii przepływowej FRET
UWAGA: Przed pobraniem komórek - zazwyczaj 24-48 godzin po leczeniu - możliwe jest uzyskanie wstępnego odczytu aktywności wysiewu za pomocą filtra zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) na standardowym odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym. Komórki traktowane bez materiału siewnego (tj. Puste liposomy) będą wykazywać rozproszoną fluorescencję, podczas gdy komórki traktowane materiałem siewnym będą wykazywać intensywne punktowe i siatkowate wtrącenia wewnątrzkomórkowe (ryc. 1A-B).
- Za pomocą pipety wielokanałowej odessać pożywkę komórkową (150 μl). Trypsynizować (50 μl) komórki przez 5 minut i schłodzić 150 μl schłodzonej pożywki hodowlanej. Na tym etapie nie należy włączać płukania PBS przed trypsynizacją, ponieważ może to spowodować podnoszenie komórek, a następnie ich utratę. Wyklucz wszelkie zanieczyszczające martwe komórki i zanieczyszczenia podczas cytometrii przepływowej za pomocą strategii bramkowania.
- Natychmiast po schłodzeniu przenieść komórki na 96-dołkową okrągłą płytkę denną i odwirować przy 1,000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać i wyrzucić pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
- Delikatnie, ale dokładnie, ponownie zawieś osad komórkowy w 50 μl 2% paraformaldehydu i inkubuj przez 10 minut. Alternatywnie, uruchom komórki na żywo, chociaż utrwalenie zapewnia czystsze i bardziej spójne wyniki.
- Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać i wyrzucić paraformaldehyd, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
- Delikatnie, ale dokładnie, ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl schłodzonego buforu cytometrycznego przepływowego (zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), 1% FBS, 1 mM EDTA) i uruchomić płytkę tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zbrylania się komórek.
6. Cytometria przepływowa FRET
UWAGA: Użyj cytometru przepływowego, takiego jak MACSQuant VYB, który jest wyposażony w linie laserowe kompatybilne z FRET i zestawy filtrów (Tabela 2). Dla każdego kroku w tej sekcji kliknij interesującą Cię studnię, korzystając z szablonu 96 studni oprogramowania, a następnie kliknij "odtwórz", aby rozpocząć pobieranie i przepływ próbki. Twórz wykresy lub tabele statystyczne, klikając ikonę "nowe okno analizy". Parametry osi na poszczególnych wykresach dwuwymiarowych można zmienić, klikając tytuł na osi X lub Y i wybierając odpowiedni filtr. Aby przesunąć populacje komórek lub sygnały fluorescencyjne, zwiększ lub zmniejsz napięcia związane z odpowiednimi filtrami. Za pomocą tego urządzenia można uruchomić <1 000 zdarzeń na sekundę, aby zapewnić dokładne monitorowanie pojedynczej komórki.
- Wykonaj wykres dwóch zmiennych Side Scatter Area (SSC-A) vs Forward Scatter-Area (FSC-A) i przy uruchomionej linii komórkowej #1 dostosuj napięcia SSC i FSC, aż populacja komórek znajdzie się w lewym dolnym kwadrancie. Kliknij narzędzie wielokąta i zdefiniuj populację komórek (Bramka P1). Aby zapoznać się ze wszystkimi parametrami bramkowania, patrz rysunek 2.
- Utwórz wykres dwuwymiarowy FSC-H (wysokość) i FSC-A i zastosuj bramkę P1 do tego wykresu, klikając "na żywo" nad wykresem i wybierając P1. Gdy uruchomiona jest linia komórkowa #1, kliknij narzędzie wielokąta i zdefiniuj pojedyncze komórki (bramka P2).
- Wykonaj 3 wykresy histogramu, po jednym dla każdego z interesujących filtrów: CFP, YFP i FRET. Zastosuj bramkę P2 do wszystkich tych działek, klikając "na żywo" nad działkami i wybierając P2. Przy uruchomionej linii komórkowej #1 dostosuj napięcia tak, aby mediana populacji komórek w histogramach CFP, YFP i FRET mieściła się w zakresie od 0 do 1. Aby zmierzyć CFP i FRET, należy wzbudzić komórki za pomocą lasera 405 nm i wychwycić fluorescencję za pomocą filtra odpowiednio 450/50 nm i 525/50 nm. Aby zmierzyć YFP, wzbudz komórki laserem o długości 488 nm i wychwyć fluorescencję za pomocą filtra 525/50 nm. Ustawienia lasera i filtra są bardziej szczegółowo opisane w tabeli 2.
- Wykonaj kompensację rozlania się CFP na kanały FRET i YFP.
nuta: Kompensacja to proces korekcji rozlewu fluorescencji. Rozlanie się fluorescencji występuje, gdy emisja fluorescencji jednego fluorochromu zostanie wykryta w filtrze przeznaczonym do pomiaru sygnału z innego fluorochromu. Przy odpowiedniej kompensacji fluorescencja rozlewowa CFP może zostać usunięta z kanałów FRET i YFP.
nuta: Kompensacja wymaga obecności zarówno komórek fluorescencyjnych -dodatnich, jak i -ujemnych. Tak więc, aby skompensować na komórkach CFP-dodatnich (linia komórkowa #2), komórki ujemne (linia komórkowa #1) muszą zostać dodane do próbki przed serią.
- Skok 30 μl zawiesiny linii komórkowej #1 z pojedynczego dołka do 200 μl zawiesiny linii komórkowej #2 bezpośrednio przed kompensacją.
- Kliknij ikonę "Ustawienia instrumentu", a następnie zakładkę "kompensacja" i zaznacz "matryca", aby otworzyć tabelę wynagrodzeń.
- Utwórz wykres dwuwymiarowy FRET-A i CFP-A i zastosuj bramkę P2, jak opisano w kroku 6.3. Przy uruchomionych liniach komórkowych 1 + 2 kliknij ikonę "kwadrantu" i narysuj ćwiartki tak, aby populacje fluorescencji -ujemne i -dodatnie były oddzielone dwoma dolnymi kwadrantami (odpowiednio Gates LL3 i LR3).
- Utwórz tabelę statystyk, która wyświetla medianę intensywności fluorescencji (MFI) FRET dla bramek LL3 i LR3. Dostosuj parametr FRET w macierzy kompensacji, aż MFI sygnału FRET będzie równoważne między LL3 i LR3. Po tym kroku MFI sygnału FRET jest równe między komórkami niebarwionymi a komórkami CFP-dodatnimi, co sugeruje brak rozlewania się CFP do kanału FRET.
- Utwórz wykres dwuwymiarowy YFP-A i CFP-A i zastosuj bramkę P2, zgodnie z opisem w kroku 6.3. Narysuj ćwiartki (LL4 i LR4) podobnie jak w kroku 6.4.3.
- Utwórz tabelę statystyczną, która wyświetla MIF YFP dla LL4 i LR4. Dostosuj parametr YFP w macierzy kompensacji, aż MFI sygnału YFP będzie równoważne między LL4 i LR4. Po tym kroku MFI sygnału YFP jest równy między komórkami niebarwionymi a komórkami dodatnimi CFP, co sugeruje brak rozlania się CFP do kanału YFP.
- Po ustawieniu bramki i kompensacji zaznacz interesujące Cię studnie i uruchom pozostałą część płytki.
- Po uruchomieniu wszystkich próbek wyeksportuj pliki danych, klikając "plik", a następnie "kopiuj". Wybierz zakładkę "pliki danych", zaznacz folder eksperymentu i kliknij "kopiuj".
