Technika oceny hamującego wpływu ekspozycji na toksyny na miniaturowe pobudzające prądy postsynaptyczne (mEPSC)

Streszczenie

Źródło: Hubbard, K. et al., Funkcjonalna ocena biologicznych neurotoksyn w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych.J. Vis. Exp. (2015)

Film pokazuje analizę elektrofizjologiczną neuronów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych po ekspozycji na neurotoksyny. Traktowanie tych neuronów neurotoksynami botulinowymi zmniejsza częstotliwość spontanicznych miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych, potwierdzając zahamowanie transmisji synaptycznej.

Protokół

1. Adaptacja embrionalnych komórek macierzystych (ESC) do hodowli zawiesinowej bez komórek

1. Rozmrażać ESC w temperaturze 37 °C, aż pozostanie odłamek lodu.
2. Używając pipety P1000, delikatnie przenieś 1 - 2,5 x 10⁶ zdysocjowanych ESC do naczynia niepoddanego hodowli tkankowej, zawierającego 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki ESC. Inkubować w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych przez 20 godzin w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO₂ ).
3. Po 20 godzinach przemyć komórki, delikatnie przenosząc kulturę zawiesiny do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. ESC na pelety przez 3 min przy 200 x g. Podczas wirowania dodaj 10 ml świeżego naczynia ESC o średniej lub niskiej przyczepności.
4. Odessać supernatant, uważając, aby nie doszło do przemieszczenia się osadu komórkowego, i dodać 1 ml świeżej pożywki ESC do osadu komórkowego. Przenieś komórki do naczynia bakteryjnego za pomocą pipety P1000 i wróć do inkubatora.
5. Obserwuj komórki codziennie, aż agregaty staną się widoczne gołym okiem (zwykle 4 - 8 dni (d); agregaty będą miały 0,2 - 0,5 mm). Jeżeli agregaty nie są widoczne po 4 dniach, należy powtórzyć krok 1.3. Gdy agregaty są widoczne, należy oddzielić i utrzymać ESC zgodnie z opisem w sekcji 2.

2. Przejście i konserwacja ESC

1. Przenieść agregaty ESC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety o pojemności 10 ml i pozostawić kruszywa do postaci zwartego osadu (zwykle 3 - 5 minut). Odessać supernatant, uważając, aby nie rozerwać osadu komórkowego, a następnie przepłukać kruszywa 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Chociaż zaleca się osiadanie grawitacyjne, alternatywnie zamiast tego granuluj komórki o gramaturze 100 x g przez 2,5 minuty, aby zaoszczędzić czas.
2. Odessać PBS i dodać 500 μl trypsyny. Inkubować agregaty w trypsynie przez 3 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 500 μl pożywki ESC w celu rozcieńczenia trypsyny i delikatnie rozcierać 10 razy pipetą P1000 w celu rozdrobnienia agregatów. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
3. Zdeocjowane komórki osadzać przez 3 minuty przy 200 x g i ponownie zawiesić komórki do końcowego stężenia 1,0 x 10⁷ komórek/ml w pożywce ESC. Przenieść 150 μl (1,5 x 10⁶ komórek) do 10 ml świeżej pożywki ESC w naczyniu bakteryjnym o średnicy 10 cm i wrócić do inkubatora do hodowli tkankowych na 48 godzin. Nadmiar ESC można różnicować, kriokonserwować w stężeniu 1 - 5 x 10⁶ komórek/ml w 90% pożywce ESC uzupełnionej 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) lub wyrzucić.
4. Kruszywa przelotowe co 48 godzin. Kruszywa gotowe do przeładunku będą dobrze widoczne, o średnicach przekraczających 0,5 mm.
   nuta: Rozmrażanie i hodowla kriokonserwowanych, przystosowanych do zawiesiny komórek odbywa się zgodnie z krokami 1,2 - 1,4. Agregaty będą gotowe do przejazdu w ciągu 48 - 72 godzin.

3. Różnicowanie neuronalne

UWAGA: Wykonaj kroki 3.1 - 3.5 przed południem i kroki 3.7 po południu. Przegląd procedur różnicowania przedstawiono na rysunku 1A.

1. Oddziel ESC jak w krokach 2.1 - 2.5. Przenieść 350 μl (3,5 x 10⁶) zdysocjowanych ESC do 10-centymetrowego naczynia o niskim stopniu przylegania, zawierającego 25 ml pożywki różnicującej. Umieścić na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 30 - 45 obr./min w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Jest to pierwszy dzień różnicowania, określany jako dzień in vitro (DIV) -8,
   nuta: Użycie bardzo niskiej płytki mocującej zwiększa koszt metody, ale daje nieco większe plony niż bakteryjne szalki Petriego, ponieważ agregaty mogą czasami przylegać do szalek Petriego. Średnie objętości i numery komórek można odpowiednio skalować, jeśli preferowane są różne rozmiary naczyń.
2. Po 48 godzinach (DIV -6) za pomocą pipety o pojemności 25 ml przenieść agregacje komórek różnicujących się do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Natychmiast dodać świeże 25 ml pożywki różnicującej do szalki Petriego.
3. Pozwól kruszywu osiąść przez 2 - 5 minut, wytwarzając widoczną granulkę o głębokości 1 - 2 mm. Zignoruj pojedyncze komórki lub małe agregaty pozostające w zawiesinie. Ostrożnie odessać pożywkę i przenieść osad komórkowy z powrotem na szalkę Petriego za pomocą P1000. Umieścić na wytrząsarce obrotowej w inkubatorze do hodowli tkankowych.
4. Przy DIV -4 powtórz krok 3.2. Pellet będzie miał głębokość 2 - 4 mm. Zastąp 30 ml pożywki różnicującej uzupełnionej 6 μM kwasem all-trans-retinowym (RA) na płytkę Petriego. Wróć do wytrząsarki obrotowej w inkubatorze do hodowli tkankowych na dodatkowe 48 godzin.
5. Przy polu DIV -2 powtórz krok 3.3. W tym momencie śrut będzie miał głębokość 4 - 8 mm.
6. W DIV -1 przygotować powierzchnie galwaniczne jak w sekcji 4.
7. W DIV 0 rozmrozić 5 ml wstępnie podrasowanej i zamrożonej pożywki trypsynizacyjnej nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w temperaturze 37 °C przez 5 - 10 minut i umieścić w kapturze do hodowli tkankowej. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml przenieść kruszywo różnicujące do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Poczekaj, aż agregaty osiądą i ostrożnie zasysaj podłoże. Przemyć granulat dwukrotnie 10 ml PBS, pozwalając kruszywu osiąść między praniami.
8. Po drugim przemyciu PBS dodać do osadu 5 ml pożywki trypsynizacyjnej NPC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po 2,5 minuty delikatnie przesunąć probówkę.
9. Dodaj 5 ml 0,1% inhibitora trypsyny sojowej (STI), aby dezaktywować trypsynę i wymieszać przez odwrócenie. Delikatnie rozcierać 10 - 15 razy pipetą serologiczną o pojemności 10 ml, aż do uzyskania względnie jednorodnej zawiesiny komórek.
10. Powoli przenieść zawiesinę komórek do sitka o średnicy 40 μm lub 70 μm umieszczonego na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Po przefiltrowaniu całej zawiesiny dodać 1 ml pożywki N2, aby przepłukać pozostałe komórki przez filtr i granulować zawiesinę zdysocjowanych komórek przez 6 minut w temperaturze 200 x g.
11. Zassać podłoże bez naruszania osadu. Umyć komórki dwukrotnie 10 ml pożywki N2, komórki osadzać przez 5 minut przy 200 x g i rozcierać między praniami za pomocą P1000. Przed drugim praniem policz komórki za pomocą hemocytometru.
12. Zawiesić komórki w pożywce N2 w ilości 1 x 10⁷ komórek na ml i płytkować embrionalne neurony pochodzące z komórek macierzystych (ESN) o gęstości komórek 150 000 - 200 000 komórek/^cm2.
13. Przenieść nowo posiane ESN do wilgotnego inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i utrzymywać jak w sekcji 5.

4. Przygotowanie powierzchni hodowlanych do posiewu prekursorów neuronowych w DIV 0

1. Potrawy poddane działaniu kultur tkankowych należy przygotować co najmniej 1 dzień przed posiewem. Dodać wystarczającą ilość polietylenoiminy (PEI; 25 μg/ml w sterylnym_H2O) lub poli-D-lizyny (PDL; 100 μg/ml w sterylnym_H2O) w celu przykrycia plastikowych naczyń poddanych kulturom tkankowym i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
2. Rano w dniu posiewu umyć naczynia dwukrotnie podwójnie destylowanym_H2Oi raz PBS. Po ostatnim umyciu dodaj wystarczającą ilość pożywki N2, aby przykryć naczynie (np. 1 ml na dołek naczynia 12-dołkowego lub 4 ml na naczynie o średnicy 6 cm).
3. Szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 18 mm należy przygotować co najmniej jeden dzień przed posiewem neuronów. Szkiełka nakrywkowe czyścić metodą plazmy przez 4 minuty.
4. Natychmiast przenieść oczyszczone szkiełka nakrywkowe na przemyty etanolem parafilm na dnie dużego sterylnego naczynia i dodać 400 μl roztworu PEI lub PDL, przygotowanego jak w kroku 4.1. Inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.
5. Rano zmyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie wodą i dodać 5 μg/ml lamininy do PBS przez 1 - 3 godziny w temperaturze 37 °C. Przed dysocjacją neuronów należy odessać lamininę i natychmiast przenieść szkiełko nakrywkowe do studzienki 12-dołkowego naczynia zawierającego 1 ml pożywki NPC, upewniając się, że strona poddana działaniu substancji jest skierowana do góry.
6. Przechowuj naczynia i szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 °C, aż NPC będą gotowi do podania na talerzu.

5. Utrzymanie neuronów

1. W DIV 1 odessać pożywkę i zastąpić pożywką hodowlaną N2.
2. W DIV 2 i 4 odessać pożywkę i zastąpić pożywką hodowlaną B27.
3. W DIV 8 odessać pożywkę i zastąpić pożywką hodowlaną B27 zawierającą inhibitory mitotyczne w celu wyeliminowania zanieczyszczających komórek nieneuronalnych.
4. W DIV 12 zastąp pożywką hodowlaną B27.
5. Nie usuwaj DIV 12⁺ ESN z 5% CO₂, dopóki nie będzie gotowy.

6. Zmierzony test hamowania transmisji synaptycznej (MIST) do ilościowego określania miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych

UWAGA: Neurotoksyny Clostridium są najbardziej trującymi znanymi substancjami, z szacowanymi wartościami LD₅₀ dla ludzi tak niskimi, jak 0,1 - 1 ng/kg. Przed użyciem tych toksyn należy uzyskać niezbędne zgody i zastosować odpowiednie środki ostrożności.

1. Ostrożnie rozcieńczyć BoNT/A do 100x, pożądanego stężenia końcowego w pożywce ESN i ogrzać do 37 ºC. Dodać odpowiednią objętość toksyny do kultur DIV 21+ ESN, zamieszać szalkę hodowlaną i wrócić do inkubatora.
2. Jeśli komórki będą analizowane później niż 4 godziny po zatruciu, dodaj toksynę do naczynia i mieszaj bez usuwania z 5% CO_{2 ,} na przykład bezpośrednio w inkubatorze lub w komorze o stałym CO₂ .
3. W odpowiednim momencie odessać pożywkę hodowlaną ESN i dwukrotnie przemyć zewnątrzkomórkowym buforem zapisującym (ERB). Dodać 4 ml ERB uzupełnionego 5,0 μM tetrodotoksyną i 10 μM bicukuliną, blokując odpowiednio potencjały czynnościowe i antagonizując aktywność receptora GABA_A.
4. Przenieś naczynie na stanowisko do elektrofizjologii. Do testu mgły nie jest wymagana ani perfuzja, ani kontrola temperatury.
5. Wyciągnąć szkło borokrzemianowe za pomocą ściągacza do mikropipet, aby uzyskać pipetę rejestrującą o rezystancji 5-10 mΩ i napełnić ją wewnątrzkomórkowym buforem rejestrującym. Przed nagraniem delikatnie zanurz napełnioną pipetę nagrywającą w odczynniku silikonowym.
6. Za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem zapewnij nadciśnienie, gdy pipeta rejestrująca jest opuszczana do ERB. Po delikatnym wylądowaniu pipety rejestrującej na somie neuronu, który ma być zarejestrowany, usuń nadciśnienie i utwórz gigaseal. Zmniejsz napięcie podtrzymania do -70 mV. Ostrożnie zastosuj podciśnienie, aby rozbić się na konfigurację całych komórek.
7. Przełącz na cęgi prądowe, aby monitorować i rejestrować spoczynkowy potencjał membrany. Bez regulacji potencjałów złączy cieczy, spoczynkowy potencjał błony będzie wynosił od -67 do -82 mV.
8. Wykonuj ciągły zapis cęgowy napięcia -70 mV przez 4 - 5 minut, aby wykryć miniaturowe wzbudzające prądy postsynaptyczne (mEPSC).
9. Analizuj 4 minuty zarejestrowanych danych pod kątem wykrywania mEPSC za pomocą oprogramowania do wykrywania szczytów z następującymi ustawieniami: Próg, 5; Okres wyszukiwania lokalnego maksimum, 10 000 μs; Czas przed szczytem dla linii podstawowej, 5 000 μs; Okres wyszukiwania czasu rozpadu, 20 000 μs; Ułamek szczytu, aby znaleźć czas rozpadu, 0,37; Okres do uśrednienia linii podstawowej, 1 000 μs; Próg obszaru, 20; Liczba punktów do średniego szczytu, 1; Kierunek szczytu, ujemny.
10. Zbieraj i zapisuj informacje o wykrytych zdarzeniach. Podziel liczbę wykrytych zdarzeń w ciągu 4 minut przez 240, aby określić częstotliwość mEPSC w Hz.
11. Zbierz częstotliwości mEPSC dla 8 - 12 próbek kontrolnych i 8 - 12 próbek poddanych działaniu BoNT dla każdego warunku ekspozycji. Analizuj częstotliwość w porównaniu z kontrolami dopasowanymi pod względem wieku i partii. Określ istotność statystyczną % hamowania aktywności synaptycznej za pomocą jednoczynnikowej ANOVA i testu post-hoc Dunnetta.

Wyniki

Rysunek 1. ESN przystosowane do zawiesiny pozostają mitotycznie stabilne i wyrażają markery pluripotencji.(A) Schemat konserwacji i różnicowania ESC. Obecność lub brak kwasu retinowego (RZS) lub czynnika hamującego białaczkę (LIF) jest oznaczona symbolem + lub –. Przedstawiono porównanie dni in vitro (DIV) z klasycznymi etapami rozwoju (DS) dla pierwotnych kultur neuronów. ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabela 1. ESC i ESN
Nokaut DMEM	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10829-018	Podłoże: Pożywka hodowlana ESC
			Formulacja i uwagi: 500 ml
100x MEM NEAA	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11140-050	Media: przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca
			Formulacja i uwagi: 6 ml
200 mM L-alanylo-L-Glutamina	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-2115	6 ml
Kwalifikowany przez ES FBS	Zastosowana komórka macierzysta	ASM-5007	90 ml
100x antybiotyki	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	3 ml
55 mM 2-merkaptoetanol	Technologie życiowe	21985-023	1,1 ml
107 jednostek/ml LIF	Milipory	ESG1107	60 μL
Nokaut DMEM	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10829-018	Media: Pożywka różnicująca ESC
			Formulacja i uwagi: 436,6 ml
100x MEM NEAA	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11140-050	Media: przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca
			Formulacja i uwagi: 5 ml
200 mM L-alanylo-L-Glutamina	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-2115	5 ml
Surowica z kwalifikacją ESC	Zastosowana komórka macierzysta	ASM-5007	50 ml
100x antybiotyki	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	2,5 ml
55 mM 2-merkaptoetanol	Technologie życiowe	21985-023	0,9 ml
PBS Dulbecco	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8537	Media: Pożywka trypsynizująca NPC
			Formulacja i uwagi: 100 ml
0,5 mln EDTA (18,3%)	Sigma-Aldrich	3690	Podłoże: zamrozić w 5 ml podwielokrotności
			Formulacja i uwagi: 0,266 ml
trypsyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8802	50 mg tabletki powlekania
Polietylenoimina, (PEI)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3143	Głoska bezdźwięczna: Rozwiązania w zakresie powlekania powierzchni
			Formulacja i uwagi: 2,5 μg/ml w H20
Poli-D-lizyna (PDL)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7280	Nośnik: zużyć w ciągu 1 tygodnia
			Formulacja i uwagi: 100 μg/ml w H20
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	5 μg/ml w H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10565-018	Podłoże: pożywka hodowlana NPC
			Formulacja i uwagi: 492,5 ml
100x witaminy N2	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 17502-048	Media: przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca
			Formulacja i uwagi: 5 ml
100x antybiotyki	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	2,5 ml
Neuropodstawowy A	Technologie życiowe	Numer katalogowy 10888-022	Media: Pożywka hodowlana ESN
			Formulacja i uwagi: 482,5 ml
50x witaminy B27	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 17504-044	Nośnik: przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca
			Formulacja i uwagi: 10 ml
200 mM L-alanylo-L-Glutamina	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-2115	5 ml
100x antybiotyki	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955	2,5 ml
5-fluoro-2'-deoksyurydyna (5FDU)	Sigma-Aldrich	F0503	Media: 2000x Inhibitory mitotyczne podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C
			Formulacja i uwagi: dd 150 mg 5FDU i 350 mg urydyny do 10 ml Neurobasal A. Sterylny filtr, podwielokrotność i zamrożenie. Użyj 2000x w pożywce hodowlanej ESN.
Urydynę	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Ekspresowa Trypsyna	Technologie życiowe	Numer katalogowy 12605-010	Głoska bezdźwięczna: Różne
			Receptura i uwagi: przechowywać w RT
Dmso	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8418	przechowuj w RT
Inhibitor trypsyny sojowej (STI)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T6414	przechowywać w temperaturze -20 °C
etanol	Sigma-Aldrich	E7023	przechowuj w RT
kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	Nr kat. A4403	Przygotować 100 mM bulionu, rozpuszczając 100 mg kwasu askorbinowego w 5,7 ml mieszanki DMSO/etanol w proporcji 50:50.
Kwas retinowy (RZS)	Sigma-Aldrich	Czynnik R2625	Zawiesić 15 mg RZS w 9 ml 50:50 DMSO/etanol. Uzupełnij 1 ml 100 mM bulionu kwasu askorbinowego. Podwielokrotność porcji i przechowywana w temperaturze -80 °C. Stabilna przez 6 mies.
Tabela 2. Mgła
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 71386	Głoska bezdźwięczna: Zewnątrzkomórkowy bufor zapisu
			Stężenie końcowe (mM): 58.44
			MW: 140
Kcl	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 60135	Media: (ERB; pH = 7,3, 315 mO)
			Stężenie końcowe (mM): 74,56
			MW: 3,5
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S3139	Media: Stabilny w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy.
			Stężenie końcowe (mM): 119,98
			MW: 1,25
CaCl2	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 21115	Stężenie końcowe (mM): 110,98
			MW: 2
MgCl2	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 63069	Stężenie końcowe (mM): 95,21
			MW: 1
D-glukoza	Sigma-Aldrich	Kontroler G8644	Stężenie końcowe (mM): 180.16
			MW: 10
HEPESY	Sigma-Aldrich	H0887	Stężenie końcowe (mM): 238,3
			MW: 10
K-glukonian	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P1847	Media: Wewnątrzkomórkowy bufor zapisu
			Stężenie końcowe (mM): 234,5
			MW: 140
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 71386	Media: (IRB; pH = 7,3, 320 mO)
			Stężenie końcowe (mM): 58.44
			MW: 5
Mg-ATP (Mg-ATP)	Sigma-Aldrich	A9187	Media: Stabilny w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy.
			Stężenie końcowe (mM): 507.18
			MW: 2
Akumulator Li-GTP	Sigma-Aldrich	Kontroler G5884	Stężenie końcowe (mM): 523.18
			MW: 0,5
CaCl2	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 21115	Media: Stabilny w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy.
			Stężenie końcowe (mM): 110,98
			MW: 0,1
MgCl2	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 63069	Media: Stabilny w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy.
			Stężenie końcowe (mM): 95,21
			MW: 1
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889	380.35 Media: Stabilny w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy < br /> Stężenie końcowe (mM): 380,35 MW: 1
HEPESY	Sigma-Aldrich	H0887	Media: Stabilny w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy.
			Stężenie końcowe (mM): 238,3
			MW: 10
Bicuculline (Bicuculline)	Tocris powiedział:	131 Rozdział 131	Głoska bezdźwięczna: Różne
			Stężenie końcowe (mM): 0,01
			MW: 417,85
Sieć CNQX	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C239	Stężenie końcowe (mM): 0,01
			MW: 276,12
Tetrodotoksyna	Sigma-Aldrich	A8001	Stężenie końcowe (mM): 0,005
			MW: 645,74
BoNT/A-/G	Metabiologia	N/a	media:
			Stężenie końcowe (mM): TBD
			MW: 150 000
Toksyna tężcowa	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T3194	Stężenie końcowe (mM): TBD
			MW: 150 000
Sigmacote powiedział:	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał SL-2	Stężenie końcowe (mM): Nie dotyczy
			MW: Nie dotyczy
Tabela 3. Sprzęt i oprogramowanie
MiniAnalysis (wersja 6.0.7)	Synaptosoft, Inc.	N/a	Oprogramowanie do wykrywania zdarzeń
Igor Pro (wersja 6.22A)	Metryki falowe	N/a	Oprogramowanie do wizualizacji nagrań
Mistrz Łat	Heka powiedział:	N/a	Oprogramowanie do akwizycji danych
Mikroskop odwrócony Olympus IX51	Olympus	N/a
Mikromanipulator	Instrument Suttera	Zobacz materiał MPC-365
Wzmacniacz z zaciskiem krosowym	Heka powiedział:	ECB10USB
Ściągacz do mikropipet	Instrument Suttera	Zobacz materiał P-1000
Borokrzemianowe rurki kapilarne	Instrument Suttera	B150-86-10	Corning 7740
Szkiełka nakrywkowe szklane 18 mm	rybak	12-545-84
Czyścik plazmowy	Plazma Harricka	PDC-32G
Sitko do komórek (40 μm)	rybak	08-771-1
Stovall Tancerka Brzucha Shaker	rybak	Numer katalogowy: 15-453-211
Naczynia o niskiej przyczepności	rybak	05-539-101	Corning 3262
Potrawy bakteryjne	Firma VWR	Nr kat. 25384-302	Wymiary: 100 x 15 mm

powiedział: powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: (wersja angielska) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: TGL powiedział: powiedział: