Produkcja i oczyszczanie rekombinowanych przeciwciał z komórek ssaków

Streszczenie

Źródło: Shivange, Gururaj, et al. Analiza dystrybucji nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego. J. Vis. Exp.(2020).

Film wyjaśnia proces wytwarzania przeciwciał w komórkach gospodarza ssaków, od ekspresji genów do wydzielania. Obejmuje transkrypcję, translację, rozpoznawanie sygnału, prawidłowe fałdowanie i ostateczne uwolnienie do ośrodka zewnątrzkomórkowego przez pęcherzyki wydzielnicze.

Protokół

1. Ekspresja i oczyszczanie przeciwciał

1. Utrzymanie komórek CHO
   1. Hoduj komórki CHO w pożywce FreeStyle CHO uzupełnionej dostępnym w handlu 1x suplementem glutaminy w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 130 obr./min z 5% CO₂ przy użyciu delongowych kolb Erlenmeyera, szklanych lub jednorazowych.
      nuta: Zdecydowanie zaleca się stosowanie kolby z przegrodą z wentylowaną nasadką w celu zwiększenia mieszania i poprawy przenoszenia gazu w warunkach wytrząsania. Znacznie zmniejszoną wydajność przeciwciał uzyskano przy użyciu zwykłych kolb (bez przegród) ze względu na ograniczone mieszanie kultury zawiesinowej.
   2. Utrzymuj liczbę komórek w zakresie 1-5 x 10⁶ komórek/ml z >95% żywotnością komórek. Jeśli liczba komórek wzrośnie powyżej 5 x 10⁶ komórek/ml, podziel komórki. Nigdy nie pozwól, aby komórki CHO osiągnęły poziom poniżej 0,2 x 10⁶ komórek/ml.
2. Transfekcja komórek CHO
   1. Hoduj komórki CHO w 200 ml pożywki (2 x 10⁶ komórek/ml) w delong Erlenmeyer z przegrodami kolb.
      nuta: Kultury zawiesinowe hodowane w kolbach z przegrodami zawsze dawały wyższe plony białka w porównaniu z kulturami hodowanymi w kolbach bez przegrody.
   2. Do probówki o pojemności 15 ml należy pobrać 5 ml pożywki CHO FreeStyle i dodać 50 μg DNA klonu VH i 75 μg DNA klonu VL. Wiruj, aby dobrze wymieszać.
   3. Inkubować mieszaninę DNA w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      nuta: Dłuższa inkubacja zmniejsza wydajność białka.
   4. Dodać 750 μl 1 mg/ml bulionu z polietylenoiminy (PEI) do roztworu DNA i agresywnie wirować mieszaninę przez 30 sekund. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 5 minut
      nuta: PEI musi być świeży. Wielokrotny cykl zamrażania i rozmrażania PEI znacznie zmniejsza ogólną wydajność.
   5. Dodać całą mieszaninę DNA i PEI do komórek, ręcznie potrząsając kolbą. Natychmiast inkubować kolby z przegrodami Erlenmeyera z komórkami w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 130 obr./min.
3. Wyrażenie
   UWAGA: Przeciwciało ma wydzielniczy peptyd sygnałowy zmodyfikowany do jego N-końcowego końca, który pomaga w wydzielaniu przeciwciał do pożywki.
   1. Hodować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 130 obr./min w dniu 1.
   2. W dniu 2 dodaj 2 ml 100x środka przeciwzbrylającego i 2 ml 100x roztworu przeciwbakteryjnego i przeciwgrzybiczego. Ustawić kolbę na niższą temperaturę (32-34 °C), wytrząsając przy 130 obr./min.
   3. Co piąty dzień dodawaj 10 ml paszy Tryptone N1 i 2 ml 100x suplementu glutaminy.
   4. Kontynuuj liczenie komórek co trzeci dzień za pomocą hemocytometru po zabarwieniu porcji komórek barwieniem błękitem trypanowym. Upewnij się, że żywotność komórek utrzymuje się powyżej 80%.
   5. W dniu 10 lub 11 należy zebrać pożywkę do oczyszczenia przeciwciał. Wirować kulturę w temperaturze 3000 x g, 4 °C przez 40-60 minut, a następnie przefiltrować przezroczyste podłoże za pomocą filtrów butelkowych 0,22 μM.
4. Oczyszczanie
   nuta: Oczyszczanie przeciwciał przeprowadza się przy użyciu dostępnej w handlu kolumny Białko-A (patrz tabela materiałów), przy użyciu pompy perystaltycznej.
   1. Zrównoważyć kolumnę dwukolumnową objętością buforu wiążącego (20 mM fosforanu sodu o pH 7,4).
   2. Przepuścić przefiltrowaną pożywkę zawierającą przeciwciało (otrzymane w kroku 1.3.5) przez kolumnę z szybkością przepływu 1 ml/min.
   3. Umyć kolumnę dwukolumnową objętością buforu wiążącego.
   4. Eluować przeciwciało do 500 μl frakcji za pomocą 5 ml buforu elucyjnego (30 mM octanu sodu o pH 3,4).
   5. Zneutralizować pH eluowanego przeciwciała, dodając 10 μl buforu neutralizującego (3 M octan sodu o pH 9) na frakcję.
      nuta: Liczby frakcji 3-6 zawierają większość przeciwciała. Wskazane jest zachowanie wszystkich frakcji na wypadek, gdyby przeciwciało zostało eluowane w frakcji późniejszej niż oczekiwano.
   6. Zmierz stężenie oczyszczonego przeciwciała za pomocą spektrofotometru, wybierając domyślny protokół dla IgG. Końcowe stężenie przeciwciała uzyskuje się w mg/ml, biorąc pod uwagę masę cząsteczkową i współczynnik absorpcji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nośniki FreeStyle CHO	Technologie życiowe Gibco	Nr kat. # 12651-014
Anty-anty (100X)	Technologie życiowe Gibco	Nr kat. # 15240-062
Środek przeciwzbrylający	Technologie życiowe Gibco	Nr kat. # 01-0057DG
Strzykawka do insuliny BD	BD Nauki Biologiczne	Kot #329420
Suwmiarka IVIS Spectrum	PerkinElmer powiedział:	Kot #124262
CHO CD EfficientFeed B	Technologie życiowe Gibco	Nr kat. #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco)	Corning	Nr kat. # 10-13-CV
Corning 500 ml RPMI 1640	Corning	Nr kat. # 10-040-CV
Cy5 sprzężone anty-ludzkie IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Nr kat. # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Technologie życiowe Gibco	Nr kat. # 35050-061
Zestaw HiPure Plasmid Maxiprep	Invitrogen	Nr kat. # K21007
Kolumna HiTrap MabSelect SuRe	GE Opieka zdrowotna	Nr kat. # 11-0034-93
Izofluran, USP	Chciwość	Nr kat. # 11695-6777-2
Smarująca maść do oczu	Odśwież Lacri-Lube	Nr kat. #4089
Odczynnik do transfekcji PEI	Rybak termiczny	Kot # BMS1003A
Modele eksperymentalne: Linie komórkowe
Człowiek: OVCAR-3	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	ATCC HTB-161
Człowiek: komórki CHO-K	Stajnia przekształcona w naszym laboratorium	Kontroler ATCC CCL-61
Mysz: 4T1	Miły prezent od dr Chipa Landena, UVA
Mysz: MC38	Miły prezent od dr Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC	Uwierzytelniane przez profilowanie STR