Pomiar aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała HA

Streszczenie

Źródło: Bailey, M. J., et al. Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje test mierzący aktywację funkcji efektorowych limfocytów T za pośrednictwem przeciwciał. Dodanie przeciwciała monoklonalnego swoistego dla hemaglutyniny (HA) wirusa grypy do transfekowanych komórek ssaków wykazujących ekspresję HA powoduje powstanie kompleksów immunologicznych z HA. Po wprowadzeniu zmodyfikowanych limfocytów T eksprymujących receptory Fc i reportera lucyferazy, limfocyty T są aktywowane przez kompleksy przeciwciało-HA, a aktywacja ta jest wykrywana przez dodanie substratu lucyferazy i pomiar wytworzonej bioluminescencji.

Protokół

1. Ekspresja hemaglutyniny wirusa grypy poprzez transfekcję

1. Umieścić komórki ludzkiej nerki embrionalnej (HEK 293T) o gęstości 2 x 10⁴ komórek/basenik na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu białej kultury tkankowej i pozostawić na 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C (z 5% CO₂ ).
2. Komórki transfekcyjne ze 100 ng DNA kodującego hemaglutyninę wirusową i 0,2 μl odczynnika do transfekcji na studzienkę w całkowitej objętości 50 μL.
   nuta: Zarówno odczynnik plazmidowy, jak i transfektantowy rozcieńcza się w 1x Opti-Minimum Essential Media (MEM) Reduced Serum Medium.
3. Po inkubacji płytek w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 18 godzin, usunąć pożywkę transfekcyjną.

2. Ocena aktywacji aktywności lucyferazy za pośrednictwem FcRg/NFAT przez przeciwciała monoklonalne lub surowice

1. Po pierwsze, zastąp pożywkę wzrostową transfekowanych komórek 25 μl pożywki testowej (1x RPMI 1640 uzupełniony o 4% (vol/vol) surowicę bydlęcą o niskiej zawartości IgG).
2. Na oddzielnej 96-dołkowej płytce przeprowadzić czterokrotne rozcieńczenie badanych przeciwciał, zaczynając od 30 μg/ml przy użyciu pożywki testowej. Wykonaj rozcieńczenia w trzech egzemplarzach, a przykładowy układ płytek jest zilustrowany na rysunku 1A. Upewnij się, że uwzględniono kontrolę, która wyklucza przeciwciała (brak kontroli przeciwciał) i kontrolę tła (sam bufor testowy).
   nuta: Zarówno w przypadku "braku przeciwciał", jak i kontroli tła, zamiast przeciwciała dodać 25 μl buforu do oznaczania.
3. Przenieść 25 μl seryjnie rozcieńczonych przeciwciał z etapu 2.2 do odpowiednich studzienek na płytce transfekowanych komórek.
4. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C (z 5% CO_{2 )} przez 15 minut.
5. Dodać 25 μl odpowiedniej zmodyfikowanej efektorowej komórki Jurkata eksprymującej mysią FcgRIV lub ludzką FcgRIIIa (75 000 komórek/dołek). Całkowita objętość dla każdej studzienki powinna wynosić 75 μl, a początkowe końcowe stężenie przeciwciała wynosi 10 μg/ml (ryc. 1B).
   nuta: Do kontroli tła dodać 25 μl buforu testowego zamiast komórek efektorowych. Do zbadania fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał można użyć zmodyfikowanej komórki Jurkat wyrażającej ludzką FcgRIIa.
6. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 6 godzin.
7. Przed użyciem rozmrozić i ogrzać bufor substratu lucyferazy w wodzie o temperaturze 37 °C przez około 1 godzinę.
   nuta: Aby wytworzyć bufor substratu lucyferazy, rozpuść liofilizowany substrat do testu lucyferazy w dostarczonym buforze testowym. Odtworzony bufor substratu może być przechowywany w temperaturze od -30 °C do -10 °C przez okres do sześciu tygodni.
8. Dodać 75 μl / studzienkę buforu substratu lucyferazy do wszystkich studzienek z wyjątkiem kontroli w tle.
9. Czytaj na luminometrze.
10. Oblicz indukcję krotności za pomocą następującego równania: Indukcja krotności = (Wartość indukowana-Wartość tła) / (Brak wartości mAb-Wartość tła).

Wyniki

Rysunek 1: Schemat układu płytek próbnych i składu grup eksperymentalnych. (A) Stężenie wyjściowe dla każdej próbki przeciwciała wynosi 10 μg/ml i jest seryjnie rozcieńczane na płytce (kolumna 1 do kolumny 12) 4-krotnie. Każdą próbkę wykonuje się w trzech egzemplarzach. Wiersz G jest zarezerwowany dla kontrolki brak mAb, a wiersz H jest tłem. (B) Końcowa objętość dl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ogniwa HEK 293T	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-3216	Ludzkie embrionalne komórki nerkowe
Lipofektamina 2000	Technologie życiowe	11668019	Odczynnik do transfekcji
1X Opti-MEM Zredukowana pożywka w surowicy	ThermoFisher Naukowy	51985-034
Biała kultura tkankowa na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu metody	Corning, Inc.	Numer katalogowy: 3917	Płytki testowe
10X MEM	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 11430-030
Komórka Jurkat eksprymująca mysi FcgRIV	Preparat Promega	Zobacz materiał M1201	Zestaw zawiera komórki, system testowy Bio-Glo Lucyferazy, 1X RPMI i surowicę o niskiej IgG
Komórka Jurkat eksprymująca ludzką FcgRIIIa	Preparat Promega	Kontroler G7010	Zestaw zawiera komórki, system testowy Bio-Glo Lucyferazy, 1X RPMI i surowicę o niskiej IgG
Komórka Jurkat wykazująca ekspresję ludzkiej FcgRIIa	Preparat Promega	Klasa G9901	Zestaw zawiera komórki, system testowy Bio-Glo Lucyferazy, 1X RPMI i surowicę o niskiej IgG
Luminometr	BioTek	Czytnik Synergy H1 Multi-Mode	Czytnik płytek luminescencyjnych
System oznaczania lucyferazy Bio-Glo	Preparat Promega	Kontroler G7940	Zawiera bufor do oznaczania lucyferazy i substrat do oznaczania lucyferazy