UWAGA: Przeciwciała specyficzne dla HA, które hamują replikację wirusa, można ogólnie podzielić na i) te, które wiążą się na lub przylegają do miejsca wiązania receptora na szczycie głowy globularnej i ii) te, które wiążą się dystalnie domeny wiążącej receptor, która obejmuje boczną stronę głowy globularnej i obszar łodygi HA. Przeciwciała ukierunkowane na miejsce wiązania receptora zapobiegają angażowaniu się motywów kwasu sjalowego na powierzchni komórek docelowych i mogą być mierzone za pomocą testu hamowania hemaglutynacji (HI). Przeciwciała, które są HI-ujemne, takie jak przeciwciała specyficzne dla łodygi, mogą nadal hamować replikację wirusa, ale można je ocenić tylko za pomocą testów neutralizacji.
1. Kategoryzacja przeciwciał na podstawie aktywności HI
- Test HI
- W 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V dodać 25 μl 1x PBS w kolumnach od 2 do 12.
- Rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne (mAb) 7B2 (specyficzne dla głowy), 6F12 (specyficzne dla łodygi) i kontrolę izotypu do 100 μg/ml w 1x PBS i podwielokrotności 50 μl rozcieńczonych preparatów przeciwciał w kolumnie 1. Uwzględnij również kontrolę bez mAb, dodając 50 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (Figura 1A).
- Wykonać 2-krotne seryjne rozcieńczenia przeciwciał, przenosząc 25 μl z kolumny 1 do kolumny 2 i tak dalej. Wyrzucić ostatnie 25 μl z kolumny 12 (rysunek 1A).
nuta: Upewnij się, że dołączyłeś wiersz, w którym nie ma kontroli przeciwciał.
- Rozcieńczyć zapas wirusa (wirus reasortacyjny wykazujący ekspresję hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA) A/California/04/09 z wewnętrznymi segmentami A/Puerto Rico/8/34) do 8 jednostek hemaglutynacji/25 μl rozcieńczonego wirusa. Dodać 25 μl rozcieńczonego preparatu wyjściowego wirusa (8 hemaglutynacji) do każdego dołka (rzędy od A do G).
nuta: Mieszanina przeciwciał i wirusa powinna mieć końcową objętość 50 μl przy początkowym stężeniu końcowym 50 μg/ml.
- Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 45 minut.
- Do rzędu miareczkowania wstecznego (H) dodać 50 μl 1x PBS na dołkach od H2 do H12. Dodać 100 μl z 8 jednostek hemaglutynacji/25 μl do studzienki H1. Seryjnie rozcieńczyć dwukrotnie, przenosząc 50 μl z H1 do H2 i tak dalej. Wyrzucić ostatnie 50 μl z dołka H12. Na koniec dodaj 50 μl 0,5% czerwonych krwinek kurczaka (RBC) do wszystkich studzienek 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
nuta: Próbki mAb w teście powinny mieć końcową objętość 100 μl: mAb (25 μl), wirus (25 μl) i RBC (50 μl). Końcowa objętość kontroli bez mAb powinna zawierać 25 μL 1x PBS, 25 μL wirusa i 50 μL RBC.
- Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
- Wizualnie odczytaj tabliczki pod kątem aktywności HI. Jeśli odczyt jest pozytywny dla określonego przeciwciała, przejdź do kroku 2.1, aby wygenerować warianty ucieczki. Jeśli przeciwciało jest HI-ujemne, przejdź poniżej do kroku 1.2, aby ocenić, czy przeciwciało ma aktywność neutralizującą w teście hodowli komórkowej.
nuta: Pozytywny odczyt HI-aktywnego mAb jest wskazywany przez ciemnoczerwoną osadkę RBC w środku studzienki (Rysunek 1B; 7B2), która utworzy łzę, gdy 96-dołkowa płytka dna w kształcie litery V zostanie utrzymana pod kątem 45°. Ujemny odczyt nie spowoduje powstania ciemnoczerwonej osadki RBC w studni (ryc. 1B; 6F12 i brak mAb). Kontrola izotypu również nie utworzy ciemnoczerwonej osadki RBC i powinna wyglądać identycznie jak przeciwciało specyficzne dla łodygi, 6F12 lub próbka kontrolna bez mAb (Figura 1B).
2. Generowanie wariantów mutantów ucieczki
UWAGA: Przeciwciała neutralizujące, które mają lub nie mają aktywności HI, są dalej analizowane za pomocą specyficznych protokołów opisanych poniżej.
- Protokół 1: Przeciwciała HI-dodatnie/neutralizujące (Figura 2A)
- Przygotować zapas wirusa składający się z 106 jednostek tworzących płytkę miażdżycową/mililitr (PFU/ml) w 1x PBS w objętości 400 μl.
- Przygotować cztery rozcieńczenia badanego przeciwciała w rosnących stężeniach (np. 0, 0,5, 0,05 i 0,005 mg/ml) w 1x PBS w objętości 100 μl na rozcieńczenie.
UWAGA: Wirus typu dzikiego powinien być zawsze pasowany równolegle i przy braku przeciwciał. Sekwencje tych pasażowanych wirusów pomogą w rozróżnieniu między adaptacją do warunków hodowli komórkowej a mutacjami ucieczki.
- Zmieszać 100 μl z 106 PFU/ml wirusa ze 100 μl każdego rozcieńczenia przeciwciała lub 100 μl 1x PBS.
- Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C (przy 5% CO2 ). Wiruj krótko. Wstrzyknąć 200 μl każdej mieszaniny do zarodków jaj kurzych wolnych od specyficznych patogenów (SPF).
- Jaja inkubować w temperaturze 37 °C (bez CO2 ) przez 40–44 godziny.
- Jaja zakażone wirusem należy poddać w ofierze poprzez inkubację w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 godzin.
- Zbierz płyn omoczniowy z jaj, jak opisano wcześniej.
- Wykonaj test hemaglutynacji, jak opisano powyżej. Jeśli wszystkie preparaty płynu omoczniowego nie mają miana hemaglutynacji, powtórzyć od kroku 2 z rozcieńczeniami przeciwciał w zakresie od 0,005 mg/ml do 0,00005 mg/ml.
nuta: Nasycenie stężenia przeciwciała HI-dodatniego może zneutralizować wszystkie obecne cząsteczki wirusa. Dlatego może być konieczne zmniejszenie ilości przeciwciał obecnych w pasażowaniu.
- Potwierdź warianty ucieczki, wykonując test HI (krok 1.1).
nuta: Przeciwciała HI-aktywne blokują angażowanie HA motywów kwasu sjalowego na komórkach docelowych. Dlatego wirus w obecności pokrewnego przeciwciała traci zdolność do aglutynacji erytrocytów (obecność osadu krwinki czerwonej). Teoretycznie warianty ucieczki przeciwciał HI-aktywnych mogą nadal wiązać motywy kwasu sjalowego nawet w obecności pokrewnego przeciwciała, a tym samym mogą aglutynować krwinki czerwone (bez krwinek czerwonych). Jeżeli HI badanego przeciwciała jest nadal wykrywalne, należy powtórzyć protokół z kroku 2.1.2 z wyższym stężeniem początkowym przeciwciała.
