Wytwarzanie wariantów ucieczki wirusa grypy przeciwko przeciwciałom neutralizującym

UWAGA: Przeciwciała specyficzne dla HA, które hamują replikację wirusa, można ogólnie podzielić na i) te, które wiążą się na lub przylegają do miejsca wiązania receptora na szczycie głowy globularnej i ii) te, które wiążą się dystalnie domeny wiążącej receptor, która obejmuje boczną stronę głowy globularnej i obszar łodygi HA. Przeciwciała ukierunkowane na miejsce wiązania receptora zapobiegają angażowaniu się motywów kwasu sjalowego na powierzchni komórek docelowych i mogą być mierzone za pomocą testu hamowania hemaglutynacji (HI). Przeciwciała, które są HI-ujemne, takie jak przeciwciała specyficzne dla łodygi, mogą nadal hamować replikację wirusa, ale można je ocenić tylko za pomocą testów neutralizacji.

1. Kategoryzacja przeciwciał na podstawie aktywności HI

1. Test HI
   1. W 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V dodać 25 μl 1x PBS w kolumnach od 2 do 12.
   2. Rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne (mAb) 7B2 (specyficzne dla głowy), 6F12 (specyficzne dla łodygi) i kontrolę izotypu do 100 μg/ml w 1x PBS i podwielokrotności 50 μl rozcieńczonych preparatów przeciwciał w kolumnie 1. Uwzględnij również kontrolę bez mAb, dodając 50 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (Figura 1A).
   3. Wykonać 2-krotne seryjne rozcieńczenia przeciwciał, przenosząc 25 μl z kolumny 1 do kolumny 2 i tak dalej. Wyrzucić ostatnie 25 μl z kolumny 12 (rysunek 1A).
      nuta: Upewnij się, że dołączyłeś wiersz, w którym nie ma kontroli przeciwciał.
   4. Rozcieńczyć zapas wirusa (wirus reasortacyjny wykazujący ekspresję hemaglutyniny (HA) i neuraminidazy (NA) A/California/04/09 z wewnętrznymi segmentami A/Puerto Rico/8/34) do 8 jednostek hemaglutynacji/25 μl rozcieńczonego wirusa. Dodać 25 μl rozcieńczonego preparatu wyjściowego wirusa (8 hemaglutynacji) do każdego dołka (rzędy od A do G).
      nuta: Mieszanina przeciwciał i wirusa powinna mieć końcową objętość 50 μl przy początkowym stężeniu końcowym 50 μg/ml.
   5. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 45 minut.
   6. Do rzędu miareczkowania wstecznego (H) dodać 50 μl 1x PBS na dołkach od H2 do H12. Dodać 100 μl z 8 jednostek hemaglutynacji/25 μl do studzienki H1. Seryjnie rozcieńczyć dwukrotnie, przenosząc 50 μl z H1 do H2 i tak dalej. Wyrzucić ostatnie 50 μl z dołka H12. Na koniec dodaj 50 μl 0,5% czerwonych krwinek kurczaka (RBC) do wszystkich studzienek 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
      nuta: Próbki mAb w teście powinny mieć końcową objętość 100 μl: mAb (25 μl), wirus (25 μl) i RBC (50 μl). Końcowa objętość kontroli bez mAb powinna zawierać 25 μL 1x PBS, 25 μL wirusa i 50 μL RBC.
   7. Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
   8. Wizualnie odczytaj tabliczki pod kątem aktywności HI. Jeśli odczyt jest pozytywny dla określonego przeciwciała, przejdź do kroku 2.1, aby wygenerować warianty ucieczki. Jeśli przeciwciało jest HI-ujemne, przejdź poniżej do kroku 1.2, aby ocenić, czy przeciwciało ma aktywność neutralizującą w teście hodowli komórkowej.
      nuta: Pozytywny odczyt HI-aktywnego mAb jest wskazywany przez ciemnoczerwoną osadkę RBC w środku studzienki (Rysunek 1B; 7B2), która utworzy łzę, gdy 96-dołkowa płytka dna w kształcie litery V zostanie utrzymana pod kątem 45°. Ujemny odczyt nie spowoduje powstania ciemnoczerwonej osadki RBC w studni (ryc. 1B; 6F12 i brak mAb). Kontrola izotypu również nie utworzy ciemnoczerwonej osadki RBC i powinna wyglądać identycznie jak przeciwciało specyficzne dla łodygi, 6F12 lub próbka kontrolna bez mAb (Figura 1B).

2. Generowanie wariantów mutantów ucieczki

UWAGA: Przeciwciała neutralizujące, które mają lub nie mają aktywności HI, są dalej analizowane za pomocą specyficznych protokołów opisanych poniżej.

1. Protokół 1: Przeciwciała HI-dodatnie/neutralizujące (Figura 2A)
   1. Przygotować zapas wirusa składający się z 10⁶ jednostek tworzących płytkę miażdżycową/mililitr (PFU/ml) w 1x PBS w objętości 400 μl.
   2. Przygotować cztery rozcieńczenia badanego przeciwciała w rosnących stężeniach (np. 0, 0,5, 0,05 i 0,005 mg/ml) w 1x PBS w objętości 100 μl na rozcieńczenie.
      UWAGA: Wirus typu dzikiego powinien być zawsze pasowany równolegle i przy braku przeciwciał. Sekwencje tych pasażowanych wirusów pomogą w rozróżnieniu między adaptacją do warunków hodowli komórkowej a mutacjami ucieczki.
   3. Zmieszać 100 μl z 10⁶ PFU/ml wirusa ze 100 μl każdego rozcieńczenia przeciwciała lub 100 μl 1x PBS.
   4. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C (przy 5% CO_{2 ).} Wiruj krótko. Wstrzyknąć 200 μl każdej mieszaniny do zarodków jaj kurzych wolnych od specyficznych patogenów (SPF).
   5. Jaja inkubować w temperaturze 37 °C (bez CO₂ ) przez 40–44 godziny.
   6. Jaja zakażone wirusem należy poddać w ofierze poprzez inkubację w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 godzin.
   7. Zbierz płyn omoczniowy z jaj, jak opisano wcześniej.
   8. Wykonaj test hemaglutynacji, jak opisano powyżej. Jeśli wszystkie preparaty płynu omoczniowego nie mają miana hemaglutynacji, powtórzyć od kroku 2 z rozcieńczeniami przeciwciał w zakresie od 0,005 mg/ml do 0,00005 mg/ml.
      nuta: Nasycenie stężenia przeciwciała HI-dodatniego może zneutralizować wszystkie obecne cząsteczki wirusa. Dlatego może być konieczne zmniejszenie ilości przeciwciał obecnych w pasażowaniu.
   9. Potwierdź warianty ucieczki, wykonując test HI (krok 1.1).
      nuta: Przeciwciała HI-aktywne blokują angażowanie HA motywów kwasu sjalowego na komórkach docelowych. Dlatego wirus w obecności pokrewnego przeciwciała traci zdolność do aglutynacji erytrocytów (obecność osadu krwinki czerwonej). Teoretycznie warianty ucieczki przeciwciał HI-aktywnych mogą nadal wiązać motywy kwasu sjalowego nawet w obecności pokrewnego przeciwciała, a tym samym mogą aglutynować krwinki czerwone (bez krwinek czerwonych). Jeżeli HI badanego przeciwciała jest nadal wykrywalne, należy powtórzyć protokół z kroku 2.1.2 z wyższym stężeniem początkowym przeciwciała.

Rysunek 1: Test HI. (A) schemat przygotowania testu HI w celu zbadania aktywności dwóch mysich mAb H1 7B2 (specyficznych dla głowy) i 6F12 (specyficznych dla łodygi) przy użyciu 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V, oraz (B) przykład wyników testu HI

Rysunek 2: Generacja mutantów ucieczkowych. Zaproponowana metodologia będzie zależała od HI i aktywności mikroneutralizacji wykazywanej przez przeciwciało. Wytwarzanie mutantów ucieczki przeciwko (A) neutralizującym przeciwciałom HI-dodatnim może wymagać pojedynczego pasażu w jajach, podczas gdy (B) neutralizujące przeciwciała HI-ujemne może obejmować wiele pasaży ze wzrostem ilości przeciwciał w hodowli tkanki komórkowej.