Wytwarzanie rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych z kultur komórkowych ssaków

Streszczenie

Źródło: Nogales-Gadea, G. et al., Generacja rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych posortowanych limfocytów B.J. Vis. Exp.(2015)

Ten film demonstruje metodę generowania przeciwciał z komórek ssaków poprzez wprowadzenie wektorów plazmidowych z ciężkimi i lekkimi genami łańcuchowymi. Wektory te oddziałują z polietyleneniną i wnikają do komórek, tworząc polipleksy; Później są one przekształcane w pojedyncze białka i składane w kompletne przeciwciała, które są wydzielane do podłoża zewnątrzkomórkowego.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs)

1. Odwirować 25 ml heparynizowanej krwi uczestników w stężeniu 900 x g przez 15 minut, tak szybko, jak to możliwe po ekstrakcji krwi. Jeśli krwi jest mniej, odpowiednio zmniejsz ilość odczynników. Wykonaj wszystkie następne kroki w okapie.
2. Przenieś serum do czystej tubki. Może być stosowany w późniejszych etapach do zamrażania PBMC lub w przypadku pacjentów autoimmunologicznych do testowania autoprzeciwciał.
3. Rozcieńczyć krew 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 i ponownie zawiesić komórki przez pipetowanie w górę i w dół.
4. Dodać 15 ml roztworu zawierającego polisacharozę i ditrizoinian sodu (1,077 g/ml) do nowej probówki o pojemności 50 ml.
5. Delikatnie nałożyć krew na wierzch roztworu w kroku 1.4, zbliżając do siebie dwa otwory probówek, aż oba płyny zetkną się bardzo powoli, a następnie powoli zdekantować zawiesinę PBMC na wierzch probówki o pojemności 50 ml. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla dobrego oddzielenia PBMC.
6. Odwirować probówkę otrzymaną w kroku 1.5 przy 400 x g bez hamulca w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.
7. Po odwirowaniu odzyskać pipetą biały pierścień, który pojawia się w środkowej części probówki, która zawiera PBMC.
8. Umyj komórki 25 ml pożywki RPMI 1640.
9. Wirować 300 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min.
10. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 10 ml RPMI 1640. Ponownie odwirować jak w kroku 1.9.
11. Policz PBMC za pomocą komory Neubauera, jak wcześniej podano.
12. Przetworzyć PBMC jak w sekcji 2 lub przechowywać je do późniejszego wykorzystania w następujący sposób: 10 milionów PBMC do zamrożenia na probówkę kriowialną rozcieńczoną w 1 ml 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) i 90% surowicy otrzymanej w kroku 1.2. Zamrażać stopniowo i do długiego przechowywania w ciekłym azocie.

2. Barwienie PBMC do sortowania CD22+ i immunoglobuliny G (IgG+) za pomocą cytometrii komórkowej

1. Umieścić PBMC w 25-centymetrowej kolbie do hodowli komórkowych z 6 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 (uzupełnionej L-glutaminą, 10 mM buforem kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 50 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej) i pozwolić im odzyskać O/N w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% dwutlenku węgla (CO₂ ).
2. Zablokuj sterylne probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) sterylnym 4% roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem albuminy (PBS) przez noc (O/N). Umyj probówki dwukrotnie PBS i napełnij je 500 μl kompletnego podłoża RPMI 1640. Użyj tych probówek do odzyskania komórek po sortowaniu.
3. Zebrać PBMC do probówki i odwirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
4. Ponownie zawieś komórki w buforze etykietowania (patrz kroki 2.5 i 2.6) i policz je. Bufor znakujący to sterylna 2% płodowa surowica bydlęca i 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w PBS.
5. Przygotować 3 probówki FACS po 10⁵ komórek każda i ponownie je zawiesić w 100 μl buforu do etykietowania. Rurki te posłużą do zdefiniowania bramek sortowania.
   1. Do pierwszej probówki dodać 5 μl przeciwciała anty CD22 PerCP (zalecane w karcie katalogowej producenta), do drugiej probówki 20 μl przeciwciała anty IgG PE (zalecane w karcie katalogowej producenta), a do trzeciej probówki nie wrzucać nic. Inkubować na lodzie i w ciemności przez 30 minut.
6. Ponownie zawiesić 5 milionów komórek w 200 μl buforu znakującego w probówce FACS i dodać 10 μl anty CD22 PerCP i 40 μl anty IgG PE. Inkubować komórki na lodzie i ciemności przez 30 minut. Jeśli pożądane jest sortowanie większej liczby komórek, należy zwiększyć skalę wszystkich odczynników.
7. Odwirować komórki przy 400 x g z niskim hamulcem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Delikatnie zdekantować supernatant.
9. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu do znakowania. Odwirować komory przy 400 x g z niskim hamowaniem przez 5 minut przy wilgotności względnej. Powtórzyć kroki 2.7 i 2.8
10. Delikatnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 μl kompletnej pożywki RPMI.
11. Przepuść komórki przez filtr 0,45 μm. Komórki są gotowe do sortowania.

3. Sortowanie limfocytów B CD22+ i IgG+

1. Użyj 3 probówek kontrolnych, aby ustalić żywotność komórek. W kontrolce bez barwienia użyj wykresu punktowego do przodu i rozmiaru, aby zdefiniować bramkowanie limfocytów. Elementy sterujące z CD22 PerCP i anty-IgG PE służą do ustawiania bramek i bramki sortującej. Wykonaj następujące czynności: Wykonaj następujące dane.
   UWAGA: Bramka to zestaw limitów wartości (granic), które służą do odizolowania określonej grupy zdarzeń cytometrycznych, w naszym przypadku komórek, z dużego zbioru. W przypadku bramki sortującej wartości graniczne pozwalają na odtworzenie zdarzeń cytometrycznych, komórek, które znajdują się wewnątrz zdefiniowanych granic: CD22+ i IgG+.
2. Jako probówkę zbiorczą do sortowania należy użyć zablokowanych probówek z 500 μl kompletnego podłoża RPMI 1640, uzyskanego w kroku 2.2.
3. Przejdź do sortowania podwójnie dodatniego: CD22+ IgG+. Zanotuj ostateczną liczbę komórek w każdym warunku. Posortuj komórki na wierzchu komórek podajnika tak szybko, jak to możliwe.

4. Napromienianie komórek zasilających

UWAGA: Przygotuj komórki podajnika między 1 - 3 dniami przed sortowaniem. Potrzeba co najmniej 5,000 komórek wi38 na studzienkę w 96-dołkowej płytce okrągłej. Wykonaj kroki 4.1, 4.2 i 4.4 w okapie.

1. Hodować komórki wi38 w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w kompletnym pożywce RPMI 1640 (tak samo jak w przypadku PBMC), aż do osiągnięcia pożądanej liczby komórek.
2. Napromieniuj je na 50 Grayów, postępując zgodnie z protokołem opisanym wcześniej. Przeprowadzić napromienianie, gdy komórki wi38 zostaną wytrypsynizowane i ponownie zawieszone w kompletnym pożywce RPMI, lub z wi38 dołączonym do kolby hodowlanej i trypsynizowanym po napromieniowaniu. Postępuj zgodnie z metodą trypsynizacji wskazaną przez dostawcę komórek wi38. Napromienić liczbę komórek niezbędną do pokrycia studzienek potrzebnych do posiewu komórek B IgG+ (1% całkowitego PBMC obliczonego w kroku 1.11).
3. Płytka 90 μl zawierająca 5 000 napromieniowanych komórek wi38 w każdym dołku 96 okrągłych płytek dołkowych. Pozostaw studzienki w zewnętrznym rzędzie płytki puste (ponieważ szybciej odparowują) i używaj tylko 60 dołków na środku płytki do posiewania komórek. Napełnij zewnętrzne studzienki, które otaczają płytkę, 200 μl PBS.
4. Umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO_{2 do} momentu, gdy będą potrzebne.

5. Posiewanie posortowanych PBMC, zakażenie wirusem Epsteina-Barr (EBV) i jego wzrost

1. Rozcieńczyć posortowane PBMC, aby pokryć 50 komórek w 50 μl kompletnego podłoża RPMI 1640 na studzienkę na basenie na 96 okrągłych płytek dołkowych (uprzednio posianych napromienionymi komórkami wi38). Wykonuj kroki w kapturze wyposażonym do pracy z EBV.
   UWAGA: infekcja 50 komórek na studzienkę jest zoptymalizowana i zwiększa prawdopodobieństwo wytworzenia przeciwciała monoklonalnego, jednak zaleca się sprawdzenie tego za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), jak opisano wcześniej.
2. Dodać 60 μl supernatantu EBV (zawierającego 3 - 4 x 10⁸ kopii wirusa/ml) do każdej studzienki na płytce okrągłej 96 dołków. Należy zachować ostrożność podczas pracy z EBV.
3. Dodać 1 μg/ml CpG (ODN2006) do dołka.
4. Pozostawić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .
5. Wizualnie monitoruj klon rosnący pod mikroskopem po tygodniu.
   UWAGA: Kilka przykładów wzrostu komórek B można zobaczyć poniżej w sekcji wyników. Zauważ, że tempo wzrostu klonów może się różnić i może być potrzebny dodatkowy czas, aby zacząć dostrzegać pewną masę komórkową rosnącą w środku studni.
6. Po 1^st dwa tygodnie monitoruj klon rosnący pod mikroskopem świetlnym i przejdź do pierwszej wymiany pożywki. Powoli odpipetować 90 μl pożywki z górnej części dołka i zebrać na czystej 96-dołkowej płytce. (Limfocyty B leżą na dnie studni, więc nie ma ryzyka ich zasysania).
   1. Dodać do każdej studzienki 100 μl kompletnej pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 1 μg/ml CpG (ODN2006) i 50 U/ml IL2. Jeśli klony rosną, przeanalizuj tę pierwszą wymianę pożywki za pomocą testu immunoenzymatycznego immunosorbentu (ELISA), jak w kroku 6.
7. Monitoruj uprawę klonów i zmień pożywkę po 3 i 4 tygodniu ponownego wzrostu, pobierając 90 μl pożywki i dodając 100 μl kompletnej pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 1 μg/ml CpG (ODN2006) i 50 U/ml IL2. Pobrany supernatant należy wykorzystać do monitorowania produkcji IgG metodą ELISA, jak w kroku 6.
   UWAGA: Po miesiącu wzrost klonów powinien być widoczny poprzez obserwację agregatów okrągłych komórek, które zwykle leżą w środku studni o okrągłym dnie.
8. Na tym etapie zmień nośnik w taki sam sposób, jak w poprzednich tygodniach, ale tylko z kompletnymi nośnikami RPMI 1640. Dobrym wskaźnikiem, aby wiedzieć, kiedy jest właściwy moment na zmianę podłoża, jest kolor nośnika, jeśli staje się żółtawy, komórki wymagają wymiany nośnika.
9. Gdy 96-dołkowe płytki zawierają duże klony (około 5 x 10⁵ komórek), przenieś je do płaskiego dołka 24-dołkowej płytki. Dodaj 300 μl kompletnej pożywki RPMI 1640 do nowej studzienki. Ponownie zawiesić 96-dołkowy klon, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść komórki do nowego dołka, rozprowadzając je jednorodnie. W razie potrzeby dodaj nowe multimedia.
   1. Gdy studzienki 24-dołkowej płytki są pełne komórek (około 5 x 10⁶ komórek), przenieś do płaskiego dołka z 6-dołkową płytką. Dodać 2 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 do nowego dołka. Ponownie zawiesić komórki na płytce 24-dołkowej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, a następnie rozprowadzić je jednorodnie w nowej studzience.
10. Dodaj multimedia w razie potrzeby. Jeżeli komórki nie mają być utrzymywane w hodowli, należy je otopić w granulkach o gramaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przechowywać supernatanty do badania ELISA. Przemyć osad komórek raz 1 x PBS, ponownie odwirować przy 400 x g przez 5 minut i przechowywać w suchym miejscu w temperaturze -80 °C do ekstrakcji RNA.
    1. Gdy komórki w 6-dołkowej płytce zaczną się zlewać (około 20 x 10⁶ komórek), przenieś je na płytkę hodowlaną o średnicy 60 mm. Dodać 4 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 do nowej płytki. Ponownie zawiesić komórki na płytce 6-dołkowej i przenieść je tak, jak to zrobiono w krokach 5.9 i 5.10.
11. W razie potrzeby dodaj nowe multimedia. Na tym etapie należy zamrozić komórki w stężeniu 10 – 30 milionów/ml w 90% surowicy płodu cielęcego i 10% DMSO. Jeśli potrzebna jest większa ilość komórek, kontynuuj ekspansję klonów na płytkach o większej powierzchni.

6. Test ELISA do wykrywania przeciwciał IgG

1. Dozować 50 μl/basenik na płytkę ELISA z kozim przeciwciałem F(ab)₂ przeciwko ludzkiemu Fc, rozcieńczonym 1 200 w buforze powlekającym. Bufor otoczkowy zawiera 50 mM węglanu sodu (Na₂CO₃) o pH 9,6.
2. Uszczelnić płytki plastikową naklejką i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Alternatywnie inkubować w temperaturze 4 °C O/N.
3. Przemyć każdą studzienkę 6 razy 200 μl buforu do mycia. Bufor myjący zawiera 0,05% Tween-20 w 1 x PBS. Nie dotykać ani nie drapać powierzchni studzienki, na której związało się przeciwciało.
4. Blok z buforem blokującym, 100 μl/basenik. Bufor blokujący zawiera 4% beztłuszczowego mleka w proszku w PBS. Uszczelnić płytkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
5. Nie prać. Wyrzuć bufor blokujący i uderz talerzem 3 razy do góry nogami o ręcznik papierowy, aby usunąć resztki płynu.
6. Inkubuj supernatanty i standardy klonów.
   1. W pierwszym badaniu należy rozcieńczyć supernatanty klonów otrzymane w kroku 5.6 lub 5.7 1/3 w RPMI. Dla wzorców rozcieńczyć roztworem IgG dla pożywki RPMI, aby otrzymać: 1 000 ng / ml, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62,5 ng / ml, 31,25 ng / ml, 15,6 ng / ml i ślepą próbę. Użyć 50 μl/basenik i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Przeanalizuj dalsze rozcieńczenia supernatantu klonu, aby przetestować powinowactwo przeciwciał, takie jak 1/10 lub 1/100.
7. Umyj tak, jak w kroku 6.3.
8. Użyć 50 μl/studzienkę koziej F (ab)2 anty-ludzkiej peroksydazy IgG Fc sprzężonej rozcieńczonej w stosunku 1:20 000 w buforze inkubacyjnym. Bufor do inkubacji zawiera 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,02% Tween 20 w 1x PBS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
9. Umyj tak, jak w kroku 6.3.
10. Dodać 100 μl/studzienkowy roztwór substratu zawierający 0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB). Inkubować przez 10 minut, aż w studzienkach utworzy się stabilny niebieski kolor. Ostrożnie; Nie czekaj zbyt długo!
11. Zatrzymać reakcję przez dodanie 50 μl 2 M kwasu siarkowego (_H2SO4). Zmierzyć absorpcję przy 450 nm, w ciągu 30 minut po zatrzymaniu reakcji.
    UWAGA: Wszystkie supernatanty klonów z 3 odchyleniami standardowymi w stosunku do ślepej próby zostaną uznane za dodatnie na obecność ludzkich przeciwciał IgG. W celu potwierdzenia dodatnich klonów test ELISA należy powtórzyć co najmniej trzy razy w różnych supernatantach tego samego klonu. Ponadto, aby wykluczyć możliwość niespecyficznej reaktywności krzyżowej, zaleca się upewnienie się, że nie ma sygnału, gdy supernatanty są inkubowane w niepowlekanych, ale zablokowanych studzienkach. Na tym etapie można przeprowadzić test detekcyjny w celu zbadania swoistości antygenowej przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania przed przejściem do sekcji 7.

7. Izolacja RNA i synteza pierwszej nici komplementarnego DNA (cDNA) wytwarzających klonów IgG

1. Jak tylko produkcja IgG zostanie potwierdzona przez ELISA, wyekstrahuj RNA klonu.
2. Do ekstrakcji RNA z komórek rosnących w krokach 5.7 lub 5.9 należy użyć zestawu do bezpośredniej syntezy cDNA komórek w indeksie górnym III, który umożliwia uzyskanie DNA z 10 000 komórek do jednej komórki.
3. Do ekstrakcji RNA z większych ilości komórek lub z osadu przechowywanego w kroku 5.11 należy użyć zestawu do izolacji RNA o wysokiej czystości. Na tym etapie mogą być również odpowiednie inne systemy ekstrakcji RNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
4. W przypadku numerów komórek od 1 x 10⁶ do 1 x 10⁴ należy użyć systemu odwrotnej transkrypcji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Można również stosować inne systemy do syntezy pierwszej nici cDNA.

8. 1ⁱ 2 PCR do amplifikacji ciężkich i lekkich łańcuchów klonów komórek B wytwarzających IgG

1. Z cDNA klonów komórek, uzyskanym w kroku 5.6 i 5.7 i dodatnim w teście IgG ELISA w kroku 6, należy przeprowadzić PCR ze starterami wymienionymi w Tabeli 1.
2. Ustaw niezależne PCR dla każdego łańcucha IgG ciężkiego, kappa i lambda. Przygotuj roztwór podstawowy ze starterami do przodu i do tyłu w równych stężeniach. Dodać je do reakcji przy końcowym stężeniu 0,4 μM.
3. Użyj 1 μl syntezy cDNA, aby przeprowadzić 1^ST PCR. Tutaj wykonaj 20 μl reakcji, korzystając z instrukcji producenta Takara Taq. Alternatywnie użyj innych polimeraz.
4. Umieścić 1. PCR w następujących warunkach cyklu: 94 °C przez 5 minut; (50 cykli: 94 °C przez 30 sekund; 58 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 45 sekund; 72 °C przez 7 minut; pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 4 °C. Włączyć do reakcji próbę ślepą w celu wykrycia ewentualnych zanieczyszczeń.
5. Przygotować 1x TBE (89 mM tris-boranu i 2 mM EDTA). W objętości 100 ml 1x TBE dodać 1 g agarozy (1% żelu agarozowego). Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej przez około 1 minutę, aż agaroza się rozpuści. Następnie dodać 4 μl 10 mg/ml bromku etydyny (lub równoważnego barwnika DNA) i wymieszać.
   1. Wlej zawartość do tacy i poczekaj, aż się spolimeryzuje. Uruchom 5 μl mieszanki PCR w żelu, aby uwidocznić prążki. Ciężkie fragmenty łańcucha powinny mieć około 400 - 550 pz, podczas gdy lekkie łańcuchy powinny mieć około 300 - 400 pz. Jeśli prążki nie zostaną wykryte, przejdź również do 2. PCR.
6. Użyj 1 μl pierwszej mieszaniny PCR, aby przeprowadzić 2. PCR. Użyć tych samych odczynników, co w kroku 8.2, ale z użyciem odpowiedniej mieszanki starterów (patrz Tabela 1). W przypadku 2^{. PCR} należy zastosować następujące warunki: 94 °C przez 5 min; (50 cykli: 94 °C przez 30 sekund; 56,5 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 55 sekund); 72 °C przez 7 min; pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 4 °C. Włączyć do reakcji próbę ślepą w celu wykrycia ewentualnych zanieczyszczeń PCR.
7. Przygotować żel agarozowy zgodnie z opisem w ppkt 8.5. Uruchom żel, aby zobrazować produkt PCR, jak w punkcie 8.5.1 Użyj amplifikacji, które zawierają fragmenty o odpowiedniej wielkości do klonowania w kroku 9 i wytwórz przeciwciała w kroku 10.
8. Sekwencjonować DNA, stosując 10 μl reakcji zawierającej: 100 ng 2. PCR, 0,2 μM startera lub mieszaniny starterów, 1 μl terminatora i 1 μl buforu. Przeprowadzić reakcję sekwencjonowania w następujących warunkach: (25 cykli: 96 °C przez 10 sekund; 50 °C przez 5 sekund i do 60 °C przez 4 minuty); 60 °C przez 7 min; pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 4 °C.
9. Oczyść reakcje sekwencjonowania za pomocą mikrospinowych kolumn G50 zgodnie z instrukcjami producenta. Oceń sekwencje ligacji w automatycznym analizatorze sekwencji, jak opisano wcześniej. Elektroferogramy powinny być czyste i odpowiadać pojedynczej sekwencji immunoglobuliny.
   UWAGA: Jeśli produkty PCR wykazują niejasne lub mieszane sekwencje immunoglobulin, rozważ ich sklonowanie za pomocą systemu TopoTA, aby uzyskać izolowane sekwencje, a następnie przejdź do kroku 9.

9. Klonowanie i sekwencjonowanie ciężkich i lekkich łańcuchów produkujących klonów IgG

1. Przygotować 1 μg DNA wektorów pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 i pFUSEss-CHIg-hG1.
2. Strawić te wektory za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych. Użyj funkcji EcoRI i BsiWI dla pFUSE2ss-CLIg-hk, EcoRI i AvrII dla pFUSE2ss-CLIg-hl2 oraz EcoRI i NheI dla pFUSEss-CHIg-hG1. Użyj 3 jednostek każdego enzymu restrykcyjnego na 1 μg DNA wektora.
   1. Trawić jednym enzymem i oczyszczać strawiony produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Trawić drugim enzymem i oczyszczać za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (zgodnie z protokołem producenta). Wytnij interesujący nas fragment z żelu agarozowego. Przygotuj żel agarozowy jak w kroku 8.5.
3. Trawić 2. produkty PCR produkującego klonu IgG: EcoRI i BsiWI do amplifikacji łańcucha kappa, EcoRI i AvrII do amplifikacji łańcucha lambda oraz EcoRI i NheI do amplifikacji łańcucha ciężkiego. Trawić jednym enzymem i oczyszczać strawiony produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Trawić za pomocą drugiego enzymu i oczyszczać strawiony produkt za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Użyj tych samych jednostek enzymów i ilości DNA, co w kroku 9.2.
4. Zligować fragmenty PCR wewnątrz wektorów za pomocą ligazy DNA T4 16 °C O/N zgodnie z zaleceniami producenta. Stosowany stosunek powinien wynosić 1 : 2 (wektor : wstaw).
5. Użyj 1 μl ligacji do przekształcenia bakterii DH5α. Postępuj zgodnie z warunkami producenta DH5α dotyczącymi transformacji. Rozprzestrzeniaj bakterie w płytkach blasticydyny lub zeocyny, w zależności od rodzaju użytego wektora. Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.
6. Hoduj pojedyncze kolonie i ekstrahuj DNA za pomocą zestawu do miniprzygotowania, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Stosować do hodowli pojedynczej kolonii i ekstrakcji DNA zgodnie z zaleceniami producenta, z zestawu do miniprepu DNA. Przeanalizuj je przez trawienie enzymami używanymi do przygotowania wektorów i insertów, jak w krokach 9.2 i 9.3.
7. Zsekwencjonuj DNA, używając 100 ng wektora, jak to zrobiono w krokach 8.8 i 8.9.

10. Wytwarzanie przeciwciał w komórkach HEK

1. Hoduj komórki HEK w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 1% L-glukozą, 1% penicyliną/streptawidyną (DMEM+) do zbiegu 75% na 150 mm płytce do hodowli komórkowej. Wykonaj w kroku kaptura od 10.1 do 10.7.
2. Przed transfekcją należy wymienić pożywkę na pożywkę, jak poprzednio, ale bez płodowej surowicy cielęcej.
3. Dla każdej transfekcji łańcucha ciężkiego należy przygotować mieszaninę transfekcyjną z 2,5 ml DMEM (bez surowicy), 9 μg wektora z łańcuchem ciężkim, 6 μg wektora z łańcuchem lekkim i 100 μl roztworu polietylenininy (PEI) (z 1 μg/μl roztworu podstawowego). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4. Delikatnie dodać 2,5 ml mieszanki do transfekcji przygotowanej w kroku 10.3 do komórek HEK na płytce. Rozkołysz talerzem, aby rozprowadzić równomiernie.
5. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 24 godziny.
6. Zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę bez płodowej surowicy cielęcej.
7. Zbierz podłoże z talerzy 4 dni później.
   UWAGA: Przeciwciała w pożywkach można wykorzystać do scharakteryzowania ich reaktywności in vitro i in vivo.

Tabela 1. Zastosowano podkłady.

Postępowania powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: Cywilnego powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:

1st startery PCR
	Do przodu (5'-3')	Bieg wsteczny (3'-5')
IgG	5′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	3′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
	5′ L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
	5′ L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
	5′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ	5′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG	3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTGCTGCTCA
	5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTCTCTGGCTCCCAG	3′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
	5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
	5′ Pan Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ	5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCAGTCTGTGCTG	3′ Cλ CACCAGTGTGGCCTTTGGCTTG
	5′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCAGTCTGCCCTGCTG
	5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
	5′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCTCSCSCAGCYTGCTG
	5′ L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
	5′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
	5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2nd startery PCR
	Do przodu (5'-3')	Bieg wsteczny (3'-5')
IgH	5′ EcoRI VH1 CAACCAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG powiedział:	3′ NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGG GACCAG (Karaka)
	5′ EcoRI VH1 do 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG powiedział:	3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG (Dyrekcja Generalna)
	5′ EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG Ogólne Warunki	3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG KONTO
	5′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG
	5′ EcoRI VH4 CAACCAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG powiedział:
	5′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG powiedział:
	5′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG
	5′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG powiedział:
κ	5′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC (Urząd Nadzoru Budowlanego)	3′ BsiWI Jκ 1 do 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT (Jednostka Przemysłowa)	3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG Protokół CTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC (Urząd Nadzoru Budowlanego)	3′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC (Międzynarodowa Organizacja Komputerowa)
	5′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC (Działanie
	5′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA Protokół CTCAGTC (Kodeks Postępowania
	5′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC (Biblioteka Klimatyczna)
	5′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC (Agencja Statystyczna)
	5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT
	5′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG LOTNISKO ACCCAGTC
λ	5′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT GACKCAG (GACKCAG)	3′ AvrII Jλ 1 do 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC powiedział:
	5′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG powiedział:	3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC
	5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG	3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 4 do 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA (Rejestr Samochodowy)	3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC
	5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG powiedział:	3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT (Kot Angielski)
	5′ EcoR1 Vλ 7 do 8 CTTCCGGAATTCAGRCTGTG GTGACYCAG powiedział:

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Histopaque-1077 (Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 10771	roztwór zawierający polisacharozę i ditrizoinian sodu
Sortownik komórek FACSAria II	BD Nauki biologiczne
96 płytek mikrodołkowych z dnem w kształcie litery U	Costar	Numer katalogowy: 3799
Zaawansowany Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 średni	Gibco, Technologie życiowe	Numer katalogowy: 12633-020
30% supernatant linii komórkowej B95-8 zawierający EBV	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-1612	3,4 x 108 sztuk/ml
CpG2006	Szczepionka Invivogen	ODN 7909
Ogniwa Wi38	Sigma-Aldrich	90020107
Interleukina-2	Roche	10799068001
Płytki ELISA	Greiner Bio-One, Microlon	655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment kozła anty-ludzka IgG, Fcγ Specyficzny dla fragmentu (niesprzężony)	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 109-006-008
4% odtłuszczone mleko w proszku (Blotting Grade Blocker)	Biorad	Numer katalogowy: 170-6404
Ludzka IgG	Sigma	I 2511	Immunoglobulina oczyszczona HUMAN IgG, 5,6 mg / ml
Kozia F(ab)2 antyludzka IgG Fcγ (sprzężona z peroksydazą (PO))	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	Numer katalogowy: 109-036-008
Czytnik ELISA (Perkin Elmer 2030)	Perkin Elmer	2030-0050
Sprzężone z peroksydazą AffiniPure królicze anty-ludzkie IgM, Fc5μ	Jackson ImmunoResearch (badania immunologiczne Jacksona)	309-035-095
SuperScript III Cells Bezpośredni system syntezy cDNA	Invitrogen	Lata 18080-200
Biosystemy stosowane (ABI) System GeneAm PCR 2700	Biosystemy stosowane
Zestaw do izolacji RNA o wysokiej czystości	Roche	11828665001
Zestaw systemu odwrotnej transkrypcji	Preparat Promega	Samolot A3500
Rekombinowana polimeraza DNA Taq	Takara	Czynnik R001A
Podkłady (2μl)	Sigma
Ultraczysta agaroza	Invitrogen	Średnica 16500-500
Drabina 100 pz	Invitrogen	Numer katalogowy 15628-019
Ilość One 4.5.2 (Gel Doc 2000)	Biorad	Numer katalogowy: 170-8100
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	QIAGEN powiedział:	Numer katalogowy: 28106
Zestaw do sekwencjonowania cyklu BigDye Terminator v3.1	Biosystemy stosowane	4337455
Płytka reakcyjna 0,1 ml (MicroAMP Optical 96-dołkowa)	Biosystemy stosowane	4346906
Analizator genetyczny ABI300	Biosystemy stosowane	4346906
Komórki kompetentne DH5α (E. coli)	Invitrogen	Numer katalogowy: 18263-012
BEZPIECZNIK-CHIg-hG1 (4493 pz)	Szczepionka Invivogen	pfusess-hchg1
BEZPIECZNIK-CHIg-hG4 (4484 pz)	Szczepionka Invivogen	pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 punktów bazowych)	Szczepionka Invivogen	pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp)	Szczepionka Invivogen	pfuse2ss-hcll2
Średni SOC	Invitrogen	Numer katalogowy: 15544-034
Pożywka agarowa na bazie LB uzupełniona zeocyną (Fast-Media Zeo Agar)	Szczepionka Invivogen	FAS-ZN-S
Płynne podłoże na bazie Terrific Broth (TB) uzupełnione zeocyną (Fast-Media Zeo TB)	Szczepionka Invivogen	FAS-ZN-L
Zestaw do miniprzygotowania DNA	Technologia Omega Bio	Zobacz materiał D6942-02
Nanodrop (spektrofotometr ND1000)	Kropla nano
Pożywka agarowa na bazie LB uzupełniona blastycydyną (Fast-Media Blast Agar)	Szczepionka Invivogen	FAS-BL-S
Płynna pożywka na bazie Terrific Broth (TB) uzupełniona blastycydyną (Fast-Media Blast TB)	Szczepionka Invivogen	FAS-BL-L
Ekosystem	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Przekaźnik R0101S	20 000 U/ml, w 10x NEBuffer EcoRI
Język nheI	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Czynnik R0131S	10 000 U/ml, w 10x NEBuffer 2.1
Drabinka DNA 2-logarytmiczna	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	N3200S	0,1-10,0 KB, 1 000 μg/ml
XmaI (w	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Przekaźnik R0180S	10 000 U/ml, w 10-krotnym buforze CutSmart
BsiWI powiedział:	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Przekaźnik R0553S	10 000 U/ml, w 10x NEBuffer 3.1
AvrII	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Czynnik R0174S	5 000 U/ml, w 10x buforze CutSmart
FastAP Termoczuła fosfataza alkaliczna	Thermo Scientific	EF0651	1 U/μL, w 10x buforze FastAP
Kompetentne komórki DH5α	Invitrogen	Numer katalogowy: 18263-012
Mysz PE anty-ludzka IgG	BD Pharmingen	555787
anty-CD22, PerCP-Cy5.5, Klon: HIB22	Fisher naukowy	BDB563942
Zestaw QIAprep Spin Miniprep	QIAGEN powiedział:	Numer katalogowy: 27106
Terminator BigDye v3.1	Biosystemy stosowane	4337455

) powiedział: powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: języku angielskim)