Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Szczepienia zwierząt
- Podskórnie (s.c) wstrzykiwać samicom myszy BALB/c w wieku 6-8 tygodni 50 μg białka APN lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, kontrola ujemna) zmieszanej z adiuwantami raz na 2 tygodnie. Użyj kompletnego adiuwanta Freunda, który zawiera zabite termicznie prątki do początkowej immunizacji i niekompletnego adiuwanta Freunda do szczepień przypominających. Wymieszać równe objętości białka APN (lub PBS) i odpowiednio adiuwanta Freunda lub niekompletnego adiuwanta Freunda.
- Wykryć miana przeciwciał przeciwko APN w surowicy tych myszy za pomocą pośredniego testu immunoenzymatycznego (ELISA) przy użyciu płytki do mikromiareczkowania pokrytej 5 μg/ml białka APN rozcieńczonego w 0,05 M PBS (pH 9,6).
2. Technologia Hybridoma do produkcji przeciwciał monoklonalnych przeciwko APN
- Dootrzewnowo (i.p.) wstrzyknąć 100 μg białka APN wybranym myszom w celu ostatecznego wzmocnienia antygenu.
- Trzy dni później poddać myszy eutanazji za pomocą pentobarbitalu sodu (50 mg/kg, v/v, dootrzewnowo) i zwichnięcia szyjki macicy.
- Zbierz śledziony i umyj je dwukrotnie DMEM, aby usunąć krew i komórki tłuszczowe. Przefiltrować zawiesinę komórek śledziony za pomocą miedzianej siatki o oczkach 200 w celu usunięcia resztek tkanek i pobrać komórki śledziony za pomocą wirowania (1500 × g, 10 min) w celu usunięcia błony śledziony.
- Wysiewaj komórki szpiczaka mysiego SP2/0 w kolbie o średnicy 25cm2 zawierającej 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 6% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i hodowlą w temperaturze 37 °C, 6% atmosfery CO2 w celu utrzymania żywotności komórek. Po 5-6 dniach hodowli komórki osiągają 80%-90% zbieżności po resuscytacji i są w fazie logarytmu wzrostu. Pod mikroskopem komórki są okrągłe, jasne i czyste.
- Dzień przed hybrydyzacją należy pobrać makrofagi z jam otrzewnowych myszy zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą.
- Wysiewać makrofagi otrzewnowe o gęstości 0,1-0,2 × 105/ml na 96-dołkowych płytkach, z których każda zawiera 100 μl pożywki HAT (DMEM uzupełnione 10% FBS i 1x suplementem HAT) i inkubować w temperaturze 37 °C, 6% CO2 nawilżonej atmosferze przez noc.
- W celu hybrydyzacji delikatnie odessać komórki SP2/0 za pomocą pipety z 8-10 butelek i zawiesić w 10 ml pożywki DMEM bez surowicy. Umyj komórki świeżym DMEM, dwukrotnie odwiruj (1500 × g, 10 min), a następnie ponownie zawiesić w 10 ml DMEM.
- Wymieszaj ilościowo oznaczone komórki śledziony z komórkami SP2/0 w stosunku 10:1 i przenieś do probówek o pojemności 50 ml. Odwirować (1500 × g, 10 min) i odrzucić supernatant. Zbierz granulki komórek na dnie probówek i postukaj dłonią, aby poluzować granulki przed hybrydyzacją.
- Dodać 1 ml glikolu polietylenowego 1500 (PEG 1500), wstępnie podgrzanego do 37 °C, kroplami za pomocą zakraplacza do luźnych osadów komórkowych przez okres 45 sekund, delikatnie obracając dno probówki.
- Powoli dodawać 1 ml DMEM wstępnie podgrzanego do 37 °C do powyższej mieszaniny przez okres 90 s, a następnie kolejne 30 ml świeżego DMEM. Umieścić probówkę fuzyjną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut.
- Po inkubacji w ciepłej kąpieli zbierz komórki i ponownie zawiesij w pożywce HAT. Następnie hodowla na 96-dołkowej płytce zaszczepionej makrofagami otrzewnej.
- Pięć dni później dodaj 100 μl świeżej pożywki HAT do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez dodatkowe 5 dni, po czym zastąp pożywkę pożywką HT (DMEM uzupełnioną 10% FBS i 1x suplementem HT).
- Użyć płytki do mikromiareczkowania pokrytej 5 μg/ml białka APN rozcieńczonego w 0,05 M PBS (pH 9,6) do analizy przeciwciał monoklonalnych w supernatancie hybrydoma przy użyciu testu ELISA.
- Gdy zaobserwuje się pożywkę w studzienkach 96-dołkowej płytki zmieni kolor na żółty (w wyniku wzrostu komórek i uwalniania metabolitów, pH w pożywce spada do 6,8, a czerwień fenolowa zmienia kolor z fuksji na żółty) lub zaobserwowane są klastry komórek, należy pobrać 100 μl supernatantu z wybranych studzienek i dodać do dołków powlekanej płytki ELISA. Użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć wartości OD450.
- Użyj przeciwciał poliklonalnych przeciwko APN i niezakażonej surowicy myszy jako odpowiednio kontroli pozytywnej i ujemnej, a PBS jako ślepej próby. W tym badaniu stosunek OD450 próbki do kontroli negatywnej (P / N) ≥ 2,1 został uznany za standard selekcji pozytywnej.
