1. Przygotowanie antygenu białkowego N (APN) aminopeptydazy
świńskiej
UWAGA: Szczep pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) i komórki APN o stabilnej ekspresji pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 zostały skonstruowane w poprzednim badaniu.
- Odzyskaj bakterie z zamrożonego glicerolu i rozprowadź na płytkach Luria-Bertani (LB) zawierających 50 μg/ml kanamycyny (Km+) w celu izolacji pojedynczej kolonii.
- Wybierz pojedynczą kolonię ze świeżo prążkowanej płytki, hoduj w 4 ml pożywki LB (10 g/l tryptonu, 10 g/l chlorku sodu (NaCl) i 5 g/l ekstraktu drożdżowego, pH 7,2) uzupełnionej Km+ (50 μg/ml) i pozostaw do wzrostu na noc (12-16 godzin) z mieszaniem (178 obr./min) w temperaturze 37 °C.
- Rozcieńczyć przygotowane bakterie w stosunku 1:100 w świeżym bulionie Km+ LB i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 2-3 godziny, aż OD600 osiągnie 0,4-0,6.
- Dodać β-d-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG) do pożywki do końcowego stężenia 0,4 mM i inkubować kultury przez dodatkowe 10 godzin w temperaturze 16 °C.
- W związku z tym należy odwirować i zebrać bakterie za pomocą indukcji IPTG (10 000 × g, 4 °C 15 min).
- Zawiesić osad komórkowy za pomocą 5 ml buforu LEW (Lysis/Equilibration/Wash) (50 mM bezwodnego fosforanu sodu jednozasadowego (NaH2PO4) i 300 mM NaCl, pH 8,0) zawierającego 1 mg/ml lizozymu. Mieszać zawiesinę bakteryjną przez 30 minut na lodzie i całkowicie poddać sonikacji (15 s impulsu i 20 s wyłączenia, 15 min) za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego.
- Odwirować surowy lizat komórkowy w temperaturze 4 °C i 10 000 × g przez 30 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Przenieść supernatant do wstępnie zrównoważonej kolumny i inkubować 1-2 minuty przed drenażem grawitacyjnym. Powtórz ten krok trzy razy.
- Przemyć kolumnę za pomocą 20 ml buforu LEW i opróżnić grawitacyjnie. Eluować białko APN znakowane histydyną za pomocą 9 ml buforu elucyjnego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl i 250 mM imidazolu, pH 8,0) i zebrać do rurki do dializy.
- Roztwór białkowy dializować przez noc w temperaturze 4 °C w buforze węglanowo-wodorowęglanowym sodu (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 135 mM NaCl, 4,7 mM chlorku potasu, 2 mM NaH2PO4 i 10 mM dwunastowodnego fosforanu sodu dwuzasadowego, pH 7,2).
- Analizuj przy użyciu 12,0% żelu SDS-PAGE i western blot, aby ocenić czystość białka APN.
- Załaduj 5 μg białka do każdego dołka żelu i pozostaw do pracy pod napięciem 110 V przez 1,5 godziny. Następnie przenieść białko na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) na 50 minut przy napięciu 15 V. Oznaczyć stężenie oczyszczonego białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
2. Szczepienia zwierząt
- Podskórnie (s.c) wstrzykuje się samicom myszy BALB/c w wieku 6-8 tygodni 50 μg białka APN lub PBS (kontrola ujemna) zmieszanego z adiuwantami raz na 2 tygodnie. Użyj kompletnego adiuwanta Freunda, który zawiera zabite termicznie prątki do początkowej immunizacji i niekompletnego adiuwanta Freunda do szczepień przypominających. Wymieszać równe objętości białka APN (lub PBS) i odpowiednio adiuwanta Freunda lub niekompletnego adiuwanta Freunda.
- Wykryć miana przeciwciał przeciwko APN w surowicy tych myszy za pomocą pośredniego testu immunoenzymatycznego (ELISA) przy użyciu płytki do mikromiareczkowania pokrytej 5 μg/ml białka APN rozcieńczonego w 0,05 M PBS (pH 9,6).
3. Technologia Hybridoma do produkcji przeciwciał monoklonalnych przeciwko APN
- Dootrzewnowo (i.p.) wstrzyknąć 100 μg białka APN wybranym myszom w celu ostatecznego wzmocnienia antygenu.
- Trzy dni później poddać myszy eutanazji za pomocą pentobarbitalu sodu (50 mg/kg, v/v, dootrzewnowo) i zwichnięcia szyjki macicy.
- Zbierz śledziony i dwukrotnie przemyj je zmodyfikowanym medium Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, aby usunąć krew i komórki tłuszczowe. Przefiltrować zawiesinę komórek śledziony za pomocą miedzianej siatki o oczkach 200 w celu usunięcia resztek tkanek i pobrać komórki śledziony za pomocą wirowania (1500 × g, 10 min) w celu usunięcia błony śledziony.
- Nasiona komórek szpiczaka mysiego SP2/0 w kolbie o średnicy 25cm2 zawierającej 5 ml DMEM uzupełnione 6% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i hodowlą w temperaturze 37 °C, 6% atmosfery dwutlenku węgla (CO2) w celu utrzymania żywotności komórek. Po 5-6 dniach hodowli komórki osiągają 80%-90% zbieżności po resuscytacji i są w fazie logarytmu wzrostu. Pod mikroskopem komórki są okrągłe, jasne i czyste.
- Dzień przed hybrydyzacją należy pobrać makrofagi z jam otrzewnowych myszy zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą.
- Wysiewać makrofagi otrzewnowe o gęstości 0,1-0,2 × 105/ml na 96-dołkowych płytkach, z których każda zawiera 100 μl pożywki hipoksantynowo-aminoterynowo-tymidynowej (HAT) (DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1x suplementem HAT) i inkubować w temperaturze 37 °C, 6% CO2 wilgotnej atmosferze przez noc.
- W celu hybrydyzacji delikatnie odessać komórki SP2/0 pipetą z 8-10 butelek i zawiesić w 10 ml pożywki DMEM bez surowicy. Umyj komórki świeżym DMEM, dwukrotnie odwiruj (1500 × g, 10 min), a następnie ponownie zawiesić w 10 ml DMEM.
- Wymieszaj ilościowo oznaczone komórki śledziony z komórkami SP2/0 w stosunku 10:1 i przenieś do probówek o pojemności 50 ml. Odwirować (1500 × g, 10 min) i odrzucić supernatant. Zbierz granulki komórek na dnie probówek i postukaj dłonią, aby poluzować granulki przed hybrydyzacją.
- Dodać 1 ml glikolu polietylenowego 1500 (PEG 1500), wstępnie podgrzanego do 37 °C, kroplami za pomocą zakraplacza do luźnych osadów komórkowych przez okres 45 sekund, delikatnie obracając dno probówki.
- Powoli dodawać 1 ml DMEM wstępnie podgrzanego do 37 °C do powyższej mieszaniny przez okres 90 s, a następnie kolejne 30 ml świeżego DMEM. Umieścić probówkę fuzyjną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut.
- Po inkubacji w ciepłej kąpieli zbierz komórki i ponownie zawiesij w pożywce HAT. Następnie hodowla na 96-dołkowej płytce zaszczepionej makrofagami otrzewnej.
- Pięć dni później dodaj 100 μl świeżej pożywki HAT do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez dodatkowe 5 dni, po czym zastąp pożywkę pożywką HT (DMEM uzupełnioną 10% FBS i 1x suplementem HT).
- Użyć płytki do mikromiareczkowania pokrytej 5 μg/ml białka APN rozcieńczonego w 0,05 M PBS (pH 9,6) do analizy przeciwciał monoklonalnych w supernatancie hybrydoma przy użyciu testu ELISA.
- Gdy zaobserwuje się pożywkę w studzienkach 96-dołkowej płytki zmieni kolor na żółty (w wyniku wzrostu komórek i uwalniania metabolitów, pH w pożywce spada do 6,8, a czerwień fenolowa zmienia kolor z fuksji na żółty) lub zaobserwowane są klastry komórek, należy pobrać 100 μl supernatantu z wybranych studzienek i dodać do dołków powlekanej płytki ELISA. Użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć wartości gęstości optycznej 450 (OD450).
- Użyj przeciwciał poliklonalnych przeciwko APN i niezakażonej surowicy myszy jako odpowiednio kontroli pozytywnej i ujemnej, a PBS jako ślepej próby. W tym badaniu stosunek OD450 próbki do kontroli ujemnej (P / N) ≥ 2,1 został uznany za standard selekcji pozytywnej.
- Po trzech kolejnych rundach pozytywnej selekcji należy wybrać hybrydoma wykazującego zwiększoną odpowiedź serologiczną przeciwko białku APN do testu ograniczonego rozcieńczenia.
- Przygotować makrofagi otrzewnowe i nasiona na 96-dołkowych płytkach, jak opisano wcześniej.
- Zawiesić komórki hybrydoma w pożywce HT w ilości średnio 0,5-2 komórek na studzienkę i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 6% CO2 . Powtórz ten krok trzy lub cztery razy, aż dodatni wskaźnik wskazany przez test immunologiczny ELISA osiągnie 100%.
- Pod presją ciągłego zamrażania i rozmrażania wybierz dodatnie komórki hybrydoma, które są w stanie stabilnie wydzielać przeciwciała anty-APN i normalnie się namnażać.
- Każdej myszy należy podać pojedyncze wstrzyknięcie dożylne 0,3 ml pristanu (8-10 tygodni). Po 10 dniach od otrzymania nieskazitelnego białka wstrzyknij każdej myszy 2-5 x 105 komórek hybrydoma w 0,5 ml PBS (pH 7,2).
- Ostrożnie zbierz płyn otrzewnowy z jamy otrzewnej tych myszy 8 do 10 dni po wstrzyknięciu.
- Zebrać supernatanty przez odwirowanie w stężeniu 5 000 × g przez 15 minut i oczyścić przeciwciała w supernatantach za pomocą 33% nasyconego siarczanu amonu [(NH4)2SO4] i białka A agarozy.
4. Charakterystyka przeciwciał monoklonalnych (mAb) przeciwko białku APN
- Określ podtyp immunoglobuliny pobranych mAb za pomocą systemu klonotypowania SBA-HRP. Użyj SDS-PAGE i western blot, aby ocenić czystość i swoistość mAb.
- Analizuj swoistość epitopu mAb w stosunku do białka APN za pomocą testu ELISA. Wartość addytywności (AV) to stosunek ODmAbs (a+b) do (ODmAbs-a+ODmAbs-b), który służy do oceny, czy mAb rozpoznają to samo miejsce antygenowe; ODmAbs-a i ODmAbs-b reprezentują wartości OD450 różnych przeciwciał monoklonalnych przeciwko samemu APN, amAb OD (a + b) reprezentują wartości OD450 mieszaniny 1:1 dwóch mAb przeciwko APN.
- Ocenić każdą próbkę przez co najmniej cztery powtórzenia i powtórzyć całe doświadczenie co najmniej trzy razy.
5. Ekspresja rAbs przeciwko APN
- Ekstrakcja całkowitego RNA z wyżej wymienionych komórek hybrydoma i śledziony myszy immunizowanych APN (np. TRIzol). Zsyntetyzuj komplementarne DNA (cDNA) za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta.
- Amplifikuj zmienne regiony mAb za pomocą zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i określ sekwencje łańcuchów ciężkich (VH) i łańcuchów lekkich (VL) za pomocą sekwencjonowania. Przeanalizuj geny kodujące VH i VL za pomocą narzędzia do analizy genomu myszy IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
- Połącz geny VH i VL z sekwencjami wiodącymi i sekwencyjnie sklonuj je odpowiednio do wektorów pET28a (+) i pIRES2-ZsGreen1, używając technologii bezproblemowego klonowania, aby umożliwić insercję fragmentów DNA bez blizn. Konkretne startery są wymienione w Tabeli 1.
- Hodować bakterie przekształcone w pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 w obecności 0,4 mM IPTG w wytrząsarkach orbitalnych w temperaturze 37 °C przez 10 godzin. Następnie indukuj, oczyszczaj i oceniaj ekspresję białka rAbs za pomocą rutynowego oczyszczania białka.
- Wysiać 100 μl 0,5 x 105 komórek CHO na studzienkę na 96-dołkową płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 6% CO2 przez 18-24 godziny. Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, rozcieńczyć plazmid pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN za pomocą Opti-MEM do końcowego stężenia 0,1 μg/μL i inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem do transfekcji.
- Delikatnie wymieszać 50 μl rozcieńczonego plazmidu pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN z 1 μl Lipofectamine 2000 i 49 μl Opti-MEM i inkubować mieszaninę przez dodatkowe 20 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 100 μl mieszaniny do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej komórki CHO i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 6% CO2 przez 4-6 godzin.
- Po 4-6 godzinach od transfekcji należy zastąpić pożywkę pożywką DMEM-F12 uzupełnioną 10% FBS i inkubować płytkę przez kolejne 48 godzin. Następnie dodaj 400 μg/ml G418 do każdej studzienki, aby wybrać stabilnie transfekowane komórki.
- Po 10 dniach selekcji przy użyciu pożywki DMEM-F12 uzupełnionej 10% FBS i 400 μg/ml G418, posortuj komórki (3,0 × 107 komórek/ml) przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Około 10-15% populacji komórek było dodatnich.
- Seryjnie rozcieńczone zebrane komórki dodatnie, wysiewać średnio 0,5-2 komórki na studzienkę na 96-dołkowej płytce i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 6% CO2 . Utrzymuj stabilnie transfekowane komórki pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO za pomocą selekcji za pomocą G418 (200 μg/mL).
- Stężenie FBS w wyżej opisanej pożywce do hodowli komórkowych zmniejsza się stopniowo od 10% do 0% w logarytmicznej fazie wzrostu przez okres 3 tygodni. Następnie przystosuj przylegające komórki CHO do wzrostu zawiesiny w podłożu bez surowicy.
- Wyhodować wysiane komórki pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO w logarytmicznej fazie wzrostu w pożywce wolnej od surowicy o gęstości 0,8-1,0 × 105 komórek/ml w kolbach wstrząsowych przy prędkości wytrząsania 80-110 obr./min i 37°C, 6% CO2 .
- Zawiesinę komórek należy zbierać co 12 godzin, aby określić zmiany w żywotności i żywotności komórek za pomocą zestawu do liczenia komórek (np. CCK-8) zgodnie z instrukcjami producenta.
- Ekspresja przeciwciał osiąga szczytowy poziom, gdy żywotność komórek spadła do 80%, a gęstość komórek osiąga 1,0-2,0 × 106 komórek/ml. Zebrać supernatanty komórkowe za pomocą wirowania, przefiltrować za pomocą filtra membranowego z politetrafluoroetylenu o wielkości 0,22 μm i oczyścić za pomocą białka A.
- Potwierdź wytwarzanie przeciwciał specyficznych dla APN za pomocą pośrednich testów immunofluorescencyjnych (IFA).
- Określić miana przeciwciał i powinowactwo wiązania za pomocą testu ELISA, jak opisano wcześniej. Obliczyć stałą dysocjacji równowagi (wartość K, D) przeciwciał za pomocą czteroparametrowego równania logistycznego za pomocą oprogramowania.
Tabela 1. Konkretne startery użyte w tym badaniu.
| podkład | Sekwencja (5'-3') |
| VH-VL-F | CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG |
| VH-VL-R | CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT powiedział: |
| pET28a (+)-F | TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA |
| pET28a (+)-R | CTGGTGCCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC |
| pIRES2-ZsZielony1-F | CGACGGTACCGCGGGCCCCCTAACAACGGTCGTGATTCGA |
| pIRES2-ZsGreen1-R | GGGGGGGGGGAGAGGGGGGGGTGGGATACCCGTATTACCC |
