Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Izolacja PBMC i wzbogacanie/oczyszczanie komórek NK
UWAGA: Można również zastosować inne metody izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i wzbogacania/oczyszczania.
- Pobrać 200 ml krwi w regulowanych warunkach do probówki zawierającej heparynę.
- Dodać 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do probówki o pojemności 50 ml z wbudowaną porowatą barierą. Wiruj probówkę o masie 1000 x g przez 30 s.
- Dodaj 12,5 ml krwi do probówki, a następnie kolejne 12,5 ml PBS i delikatnie odwróć 3x. Wiruj probówkę przy 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerw
.
- Przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml z 40 ml PBS dla każdej probówki z porowatą barierą, podczas gdy komórki się obracają.
- Ostrożnie wyjmij probówki i sprawdź po odwirowaniu. Sprawdź, czy nad porowatą barierą, między granicami 20 ml i 25 ml na probówce 50 ml nie ma cienkiej, widocznie białej warstwy PBMC.
- Ostrożnie usuń jak najwięcej płynu z wierzchu za pomocą pipety, nie naruszając cienkiej, białej warstwy PBMC.
- Za pomocą czystej pipety serologicznej o pojemności 10 ml delikatnie usuń warstwę PBMC wraz z przezroczystą, żółtawą warstwą cieczy aż do filtra probówki.
- Wyrzucić PBMC i ciecz do stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml zawierającego PBS, przygotowanego w kroku 1.4. Wiruj rurki przy RT i 300 x g przez 5 min.
- Odessać płyn do płukania PBS i dodać dodatkowe 40 ml PBS. Wiruj rurki przy RT i 300 x g przez 5 min.
- Po umyciu policz komórki i zawieś je ponownie w 40 μl 2% BSA/PBS na 1 x 107 komórek.
- Przystąp do izolacji komórek NK przy użyciu wybranej metody. Do wyboru jest ręczne lub automatyczne sortowanie magnetyczne oparte na kulkach. Można również przeprowadzić sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.
- Usunąć małą porcję komórek, aby określić czystość komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej. Strategia bramkowania obejmuje następujące elementy: bramkę na żywych komórkach w oparciu o profil rozproszenia do przodu i boku, a następnie ocenę czystości na podstawie markerów NK (np. CD3, CD56) w określonej żywej populacji. Typowa czystość wynosi >95%.
- Po zakończeniu izolacji, wiruj komórki w temperaturze RT i 300 x g przez 5 minut, aby osadzać i aspirować.
- Zawiesić osad komórkowy na 1 x 107 komórek/ml w RPMI 1640 ze składnikami odżywczymi, 10% inaktywowanym termicznie FBS, 1 mM pirogronianem sodu, 55 mM 2-ME i 10 mM HEPES (pH = 7,2).
2. Aktywacja komórek NK za pośrednictwem przeciwciał poprzez FcγRIIIa
- Ustawić schłodzoną mikrowirówkę na 4 °C.
- Dozować 1 x 106 (100 μL) zawieszonych komórek NK do probówki (probówek) o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie.
nuta: Komórki można dozować do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, jeśli istnieje wiele próbek.
- Przygotować 1 μl rytuksymabu o stężeniu 100 μg/ml rytuksymabu (lub przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania) na próbkę i dodać 1 μl do komórek, aby uzyskać końcowe stężenie przeciwciała 1 μg/mL.
nuta: Inne cząsteczki mogą zostać dodane do komórek w tym momencie lub wcześniej w celu oceny efektów połączenia. W tym przypadku do stymulacji stosowano rytiksumab. We wcześniejszych badaniach do stymulacji dodawano inhibitory małocząsteczkowe.
- Inkubować próbkę na lodzie przez 30 minut. Podczas inkubacji przygotować 50 μl 50 μg/ml przeciwciała przeciwko ludzkiemu łańcuchowi lekkiemu κ na próbkę w pożywce i ogrzać do 37 °C na bloku grzewczym lub w łaźni wodnej.
- Po inkubacji komórek na lodzie dodać 1 ml lodowatej pożywki i wirować w temperaturze 135 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie przemyć 1 ml lodowatego podłoża.
- Odessać supernatant po ostatnim przemyciu i dodać 50 μl mieszaniny łańcuchów lekkich κ przeciwko człowiekowi, przygotowanej w kroku 2.4.
- Natychmiast inkubować próbki w określonych przez użytkownika końcowego punktach czasowych w temperaturze 37 °C na bloku grzewczym lub w łaźni wodnej.
- Przerwij stymulację, dodając 1 ml lodowatego podłoża i natychmiast odwiruj próbki w wirówce z chłodzeniem o sile 135 x g przez 5 minut. Przemyj ponownie 1 ml lodowatego podłoża.
