Technika wytwarzania przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B specyficznych dla antygenu

Streszczenie

Źródło: Devilder, M., et al. Generacja dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi. J. Vis. Exp. (2018).

Film demonstruje technikę generowania przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B specyficznych dla antygenu. Eukariotyczne wektory ekspresyjne kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciał, sklonowane z izolowanych komórek B specyficznych dla antygenu, wprowadza się do komórek ssaków za pomocą polipleksów. Po wejściu do komórek wektory te ulegają translacji, a powstałe peptydy o ciężkich i lekkich łańcuchach łączą się w przeciwciała, które są następnie wydzielane przez komórki.

Protokół

1. Produkcja mAbs

1. Dzień przed transfekcją wysiewa 15 000 ludzkich embrionalnych komórek nerki 293A (HEK 293A) w 200 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% FBS na studzienkę na płytkach 96-dołkowych. Inkubować przez noc w inkubatorze CO₂ (5 % CO_{2 )} w temperaturze 37 °C.
2. Komórki kotransfekcyjne 293A w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS przy użyciu liniowej pochodnej polietyleniny jako odczynnika do transfekcji.
   nuta: Wykonaj transfekcję w trzech egzemplarzach. Poniższy protokół dotyczy jednego dołka na 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
   1. Rozcieńczyć 0,5 μl odczynnika do transfekcji DNA w 10 μl 150 mM NaCl. Rozcieńczyć 0,125 μg zmiennych łańcuchów ciężkich (vH) i 0,125 μg wektorów wyrażających zmienny łańcuch lekki (vL) w 10 μl 150 mM NaCl. Wirować każde rozcieńczenie przez 10 s.
   2. Dodać 10 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji DNA do 10 μl roztworu DNA. Wirować 15 s i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 20 μl mieszanki kroplami na ogniwa 293A i wymieszaj, delikatnie obracając płytkę.
3. Wymień pożywkę 16 godzin po transfekcji i hoduj komórki przez 5 dni w pożywce bez surowicy.
   nuta: Stosować pożywkę bez surowicy, aby uniknąć zanieczyszczenia wytworzonych przeciwciał przez immunoglobuliny surowicy (Ig).
4. Usunąć komórki i zanieczyszczenia przez odwirowanie przy 460 x g przez 5 minut.
5. Zebrać supernatanty przez aspirację za pomocą pipety wielokanałowej i przenieść je do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
6. Pokryć odpowiednią Ag przez noc w temperaturze 4 °C w 100 μl na basenik w odtworzonym teście immunoenzymatycznym (ELISA) / buforze powlekającym immunoenzymatyczne plamki immunoenzymatyczne (ELISPOT) 1x przy końcowym stężeniu 2 μg/ml na 96-dołkowych płytkach ELISA.
7. Studzienki blokowe z 10% podłożem FBS DMEM przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
8. Dodać 50 μl supernatantów transfekowanych komórek 293A z kroku 1.5 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
9. Dodać 100 μl przeciwciała anty-ludzkiej immunoglobuliny G (IgG Ab) sprzężonego z enzymem peroksydazy chrzanowej (HRP) w stężeniu 1 μg/ml i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodać 50 μl substratu chromogennego (3,3',5,5' tetrametylobenzydyny, TMB) i inkubować przez 20 minut.
10. Odczyt gęstości optycznej przy 450 nm na spektrofotometrze.
    nuta: Specyficzne przeciwciała monoklonalne ujawnione w teście ELISA mogą być dalej wytwarzane na dużą skalę i oczyszczane na kolumnie białka A wykazującej powinowactwo do ludzkiej IgG.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórkowa HEK 293A	Thermo Fisher naukowy	Silnik R70507
DMEM (1X) Zmodyfikowany Orzeł Dulbecco Medium	Gibco przez technologie życia	21969-035	(+) 4,5g/L D-glukoza 0,11g/L Pirogronian Sodu (-) L-Glutmine
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Odczynnik do transfekcji DNA Jet PEI	PoliPlus	Rozdział 101-40
Płaskie dnoPłytka 96-dołkowa	sokół	353072
Płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery V	Nunc/Thermofisher	Numer katalogowy: 55142