Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie cewników krokowych
- Przygotowanie rurki ze stopionej krzemionki do etapu cewnika
- Przyciąć kapilarę z topionej krzemionki o średnicy wewnętrznej 0,1 mm i grubości ścianki rurki 0,0325 mm na długość 30 mm.
- Sprawdź rurkę pod kątem pęknięć i wypoleruj na gorąco końce za pomocą mikrokuźni, aby upewnić się, że otwory rurki mają gładką powierzchnię.
- Mocowanie dętki w metalowej igle
- Zamontuj igłę 27 G na strzykawce o pojemności 10 μl i umieść strzykawkę w robocie stereotaktycznym.
- Za pomocą robota przesunąć strzykawkę po twardej powierzchni i dotknąć jej końcówką igły. Pozycja ta powinna być zanotowana lub zapisana w oprogramowaniu, ponieważ będzie ona służyć jako powierzchnia odniesienia do ustawiania długości kroku cewnika.
- Podnieś igłę, aby umożliwić umieszczenie stopionej kapilary krzemionkowej wewnątrz igły.
- Umieścić stopioną kapilę krzemionkową w igle tak, aby 20 mm kapilary wystawało z igły.
- Za pomocą pipety równomiernie rozprowadzić 2 μl kleju cyjanoakrylowego o wysokiej lepkości na kapilarze, zaczynając od metalowej igły i kończąc 10 mm powyżej dolnego końca kapilary, jak pokazano na rysunku 1.
- Za pomocą robota stereotaktycznego opuść igłę, aż końcówka metalowej igły znajdzie się 1 mm nad powierzchnią odniesienia. W ten sposób stopiona kapilara krzemionkowa zostanie zamocowana w metalowej igle, tworząc odstęp 1 mm od końcówki. Usuń nadmiar kleju tworzący się na końcu metalowej igły, aby uniknąć stępienia stopnia.
- Odczekaj 15 minut, aż klej stwardnieje i wyjmij strzykawkę z cewnikiem z robota stereotaktycznego. Upewnij się, że cały nadmiar kleju został usunięty na etapie, sprawdzając końcówkę cewnika pod mikroskopem.
- Testowanie cewnika krokowego za pomocą bloku agarozy
- Przygotuj 0,6% roztwór agarozy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w konwencjonalnej tacce żelowej i poczekaj, aż się spolimeryzuje. Pokrój agarozę na bloki o wymiarach około 20 mm x 20 mm. Do czasu użycia trzymaj bloki zanurzone w PBS.
- Ręcznie napełnić strzykawkę z cewnikiem schodkowym 10 μl 0,4% roztworu przefiltrowanego błękitu trypanowego.
- Za pomocą robota stereotaktycznego dozować 1 μl przy 0,2 μl/min, aby ocenić szczelność etapu cewnika podczas procedury mocowania. Roztwór błękitu trypanowego powinien być widoczny wyłącznie na końcówce cewnika. Wytrzyj go chusteczką papierową.
- Umieść blok agarozy w robocie stereotaktycznym i skalibruj robota tak, aby końcówka cewnika była skierowana do powierzchni bloku agarozowego.
- Zaprogramuj parametry wtrysku dla CED.
- W przypadku objętości iniekcji wynoszącej 5 μl należy postępować zgodnie z następującymi krokami: 1 μl przy 0,2 μl/min, następnie 2 μl przy 0,5 μl/min i 2 μl przy 0,8 μl/min. Dostosować końcową objętość wstrzyknięcia zgodnie ze szczegółowym planem doświadczalnym, proporcjonalnie zmieniając czas trwania każdego z etapów.
- Aby wstrzyknąć roztwór do mysiej skorupy ogoniastej (prążkowia), należy wykonać takie wstrzyknięcie w pozycji 1 mm przodem i 1,5–2 mm bokiem od bregmy na głębokości 3,5 mm.
- Po wstrzyknięciu należy pozostawić cewnik na miejscu na 2 minuty, a następnie wycofać się z prędkością 1 mm/min, aby zapewnić prawidłowe rozproszenie płynu w mózgu i uszczelnić drogę iniekcji podczas usuwania cewnika.
nuta: Wszystkie parametry można zaprogramować w jednym skrypcie w zależności od konkretnego robota stereotaktycznego.
- Rozpocznij procedurę CED i wstrzyknij 5 μl roztworu błękitu trypanowego do bloku agarozy.
- Oceń kształt chmury błękitu trypanowego w agarozie i potencjalny wyciek wzdłuż drogi cewnika. Błękit trypanowy powinien tworzyć elipsoidę lub okrągłą chmurę ze środkiem wokół końcówki cewnika i średnicą co najmniej 1 mm. Nie powinien być widoczny żaden większy przepływ wsteczny przez końcówkę metalowej igły.
- Umieścić nowy blok agarozy i rozpocząć drugie wstrzyknięcie 1 μl w tempie 0,2 μl/min, aby ocenić zatkanie cewnika agarozą. Błękit trypanowy powinien ponownie zacząć tworzyć chmurę z końcówki cewnika natychmiast po rozpoczęciu wstrzyknięcia.
- Ocenić, czy pozostała objętość w strzykawce odpowiada 3 μl. Wszelkie odchylenia mogą wskazywać na wyciek płynu przez mocowanie cewnika lub tłok strzykawki.
- Jeśli wszystkie wstrzyknięcia testowe zakończą się pomyślnie, cewnik jest dobrze uszczelniony i prosty, a roztwór błękitu trypanowego nie jest obserwowany w innych miejscach niż końcówka cewnika, umyj cewnik dejonizowanymH2O(dH2O), aż nie będą widoczne ślady błękitu trypanowego, a następnie przemyj dziesięć razy w następujący sposób: 70% etanolu i 100% etanolu, a następnie ponownie przepłucz 70% etanolem i czystą wodą dejonizowaną.
- Cewnik należy przechowywać w suchych warunkach.
2. Konwekcja wspomagana dostarczaniem roztworu przeciwciał do mysiego mózgu
UWAGA: W zależności od lokalnych przepisów dotyczących dobrostanu zwierząt, różne rodzaje środków znieczulających, przeciwbólowych i antybiotyków mogą być stosowane do tej procedury. Protokół ten opisuje zastosowanie znieczulenia iniekcyjnego. Wziewne środki znieczulające, takie jak izofluran, mogą być również stosowane poprzez zamontowanie maski na nos na ramie stereotaktycznej. Ponadto zalecamy dodawanie antybiotyków do wody pitnej w celu zapobiegania infekcjom.
- Konfiguracja chirurgiczna
- Przygotuj środki znieczulające i roztwory antidotum. Myszy można bezpiecznie znieczulić za pomocą trójskładnikowego środka znieczulającego zawierającego fentanyl (0,05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) i medetomidynę (0,5 mg / kg) rozcieńczonych w sterylnej wodzie destylowanej (dH2O). Przeprowadzamy dwuetapową procedurę budzenia przy użyciu dwóch roztworów antidotum, jednego zawierającego flumazenil (0,5 mg/kg) i buprenorfinę (0,1 mg/kg) w sterylnymdH2O (pierwszy roztwór antidotum). Drugi zawiera atipamezol (2,5 mg/kg) w sterylnym dH2O (drugi roztwór antidotum).
- Przygotować roztwór przeciwbólowy zawierający karprofen (5,667 mg/kg) rozcieńczony jałowym dH2O.
- Wyczyść ramę stereotaktyczną, poduszkę grzewczą i elementy robota stereotaktycznego. Należy pamiętać, że nie wszystkie części robota można wyczyścić bez ryzyka uszkodzenia. Zapoznaj się z instrukcją obsługi robota, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat czyszczenia i przygotowania do użycia.
- Zmontować strzykawkę z cewnikiem schodkowym i przepłukać ją wielokrotniedH2O, 70% etanolem i 100% etanolem, a następnie ponownie przepłukać 70% etanolem idH2O. Na koniec przepłukać strzykawkę PBS lub innymi w celu przygotowania roztworu do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego, np. sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego. Tłok strzykawki powinien poruszać się płynnie i swobodnie podczas zabiegu.
- Skalibruj oprogramowanie robota stereotaktycznego z ramką stereotaktyczną.
- Przetestuj oprogramowanie robota stereotaktycznego, upewniając się, że ramiona robota poruszają się swobodnie, że pompa wtryskowa jest prawidłowo podłączona i że może wykonać procedurę CED bez żadnych zakłóceń. Obejmuje to testowanie ruchu robota, wstrzykiwanie z rampą, sprawdzanie 2-minutowego kroku oczekiwania i sprawdzanie szybkości wycofywania cewnika. Wszystkie parametry powinny być zgodne z zaprogramowaną procedurą CED opisaną w ppkt 1.3.5.
- Włóż wiertło do wiertła. Zaleca się sterylizację wierteł przed użyciem.
- Przygotuj roztwór przeciwciała przy użyciu PBS lub innych roztworów buforowych, takich jak sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF). Od 1 do 20 μg przeciwciała w 5 μl można wstrzyknąć w jednej procedurze CED. Inne objętości i ilości białka powinny zostać zbadane przed przeprowadzeniem eksperymentu. Należy pamiętać, że stosowanie roztworów o wysokiej lepkości może prowadzić do zatkania cewnika.
- Ręcznie naładować strzykawkę rozcieńczonym przeciwciałem.
- Iniekcja przeciwciała przez CED do prążkowia
- Zważ mysz i wstrzyknij trójskładnikowy roztwór znieczulający do otrzewnej w zależności od masy ciała. Zwróć uwagę na czas wstrzyknięcia. Przenieś mysz do osobnej klatki ogrzewanej poduszką grzewczą.
- Obserwuj mysz, aby określić, kiedy zaczyna się sedacja. Gdy mysz przestanie się poruszać, nałóż maść okulistyczną na oczy, aby chronić rogówkę przed wysuszeniem podczas zabiegu. Pełna sedacja rozpoczyna się zwykle 10–15 minut po wstrzyknięciu trójskładnikowego roztworu znieczulającego.
- Sprawdź reakcje bólowe za pomocą testu odruchu szczypania, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone.
- Ogol głowę za pomocą trymera do włosów.
- Zdezynfekuj skórę wacikami nasączonymi roztworem jodu. Wyszoruj skórę trzy razy okrężnymi ruchami.
- Wykonaj 10-milimetrowe nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej czaszki, kończąc na poziomie oczu za pomocą skalpela.
- Zamocuj mysz w ramce stereotaktycznej za pomocą zacisku na nos i nauszników. Upewnij się, że powierzchnia czaszki jest pozioma i szczelnie zabezpieczona. Oprócz prawidłowej nawigacji anatomicznej, kluczowe jest również unikanie przechylania czaszki podczas wiercenia i procedury CED.
- Umieść strzykawkę w robocie stereotaktycznym.
- Zsynchronizuj wiertło z końcówką cewnika w punkcie odniesienia. Zależność między położeniem wiertła a strzykawki musi być precyzyjnie określona w oprogramowaniu, aby wstrzyknięcie można było wykonać w pożądany obszar anatomiczny mózgu.
- Cofnij skórę za pomocą kleszczy i zlokalizuj bregmę na powierzchni czaszki.
- Odwołaj się do Bregma w oprogramowaniu za pomocą końcówki wiertła.
- Przesuń wiertło do pozycji 1 mm z przodu i 2 mm z boku od bregmy i wywierć otwór na zadziory. Uważaj, aby nie uszkodzić opony twardej.
- Przesunąć strzykawkę nad otworem zadziorów.
- Dozować 0,5–1 μl ze strzykawki, aby upewnić się, że w cewniku nie pozostały pęcherzyki powietrza.
- Uruchomić program CED opisany w ppkt 1.3.5. Na powierzchni czaszki należy obserwować, czy nie ma śladów cofania się płynu z miejsca wstrzyknięcia. Monitoruj częstość oddechów zwierzęcia.
- Po zakończeniu programu CED i wyjęciu cewnika z mózgu należy uruchomić pompę iniekcyjną z prędkością 0,2 μl/min, aby sprawdzić, czy cewnik nie jest zatkany podczas CED. Jeśli nie doszło do zatkania, należy natychmiast zobaczyć kroplę mieszanki do wstrzykiwań z końcówki cewnika.
- Przed ponownym użyciem lub przechowywaniem cewnika należy wizualnie zbadać etap cewnika pod mikroskopem pod kątem oznak uszkodzenia lub zużycia i wyczyścić go jak w kroku 1.3.10.
