1. Hodowla komórek mikrogleju BV-2
UWAGA: Przechowuj komórki BV-2 pod zabezpieczeniem na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Linia komórkowa BV-2 wytwarza otoczkowy rekombinowany retrowirus ekotropowy (zdolny do infekowania tylko komórek mysich); Takie wirusy są znane ze swojej zdolności do przekształcania in vitro i potencjału rakotwórczego in vivo.
- Hodowla komórek BV-2 w zmodyfikowanym pożywce orła o wysokim poziomie glukozy Dulbecco (DMEM) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (od teraz określanej jako pożywka hodowlana) poprzez wysiewanie komórek w proporcji 4 x 104 komórek/ml.
- Utrzymywać kultury w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
UWAGA: komórki rosną luźno połączone i w zawiesinie.
2. Oznacz rekombinowane agregaty Tau barwnikiem fluorescencyjnym wrażliwym na pH
UWAGA: Agregaty Tau zostały przygotowane zgodnie z opisem w Apetri et al.z tą różnicą, że do buforu reakcyjnego nie dodano tioflawiny T (ThT). Zagregowane próbki pobrano w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Końcowy sygnał fluorescencji sprawdzono, mieszając 118 μl próbki basenowej z 12 μl roztworu 50 μM ThT. Agregaty rozdzielano przez odwirowanie mieszaniny reakcji agregacji w temperaturze 20 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Supernatant został przeanalizowany przez SEC-MALS w celu potwierdzenia, że cały monomeryczny tau został przekształcony w agregaty. Granulki (kruszywa tau) zamrażano zatrzaskowo i przechowywano w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
- Zawiesić agregaty tau w 0,1 M buforze wodorowęglanowym sodu (NaHCO3) o pH 8,5 do stężenia 1 mg/ml (~ 20 μM).
nuta: Stężenie agregatów tau opiera się na początkowym stężeniu monomerów ocenianym na podstawie absorpcji monomerów tau przy 280 nm przy użyciu współczynnika ekstynkcji 0,31 mLmg-1 cm-1.
- Sonikuj ponownie zawieszone agregaty za pomocą sonikatora sondy, utrzymując je na lodzie, aby uniknąć przegrzania.
- Użyj amplitudy 65% (z sonikatorem o mocy 250 W).
- Wykonaj 8 impulsów po 3 s z przerwami 15 s między impulsami, aby uniknąć przegrzania.
- Przygotować 8,9 mM roztwór podstawowy barwnika wrażliwego na pH (zwanego dalej barwnikiem pH) w dimetylosulfotlenku (DMSO) zgodnie z instrukcją producenta.
nuta: Zawsze przygotowuj świeży roztwór i używaj go tylko w dniu przygotowania.
- Dodaj 10 moli barwnika na mol białka do końcowego stężenia barwnika wynoszącego 0,2 mM.
- Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół.
- Mieszaninę reakcyjną inkubować przez 45–60 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
- W międzyczasie zamontuj usieciowaną kolumnę odsalającą żel dekstranowy zgodnie z instrukcjami producenta.
- Zrównoważyć kolumnę z 25 ml 0,1 M NaHCO3 bufor o pH 8,5 zawierający 3% DMSO. Odrzuć przepływ.
- Dodać produkt reakcji znakowania kruszywa tau do kolumny w całkowitej objętości 2,5 ml. Jeśli próbka jest mniejsza niż 2,5 ml, dodaj bufor, aż do uzyskania całkowitej objętości 2,5 ml.
- Pozwól, aby próbka całkowicie weszła do wypełnionego żelu, odrzuć przepływ.
- Eluować za pomocą 3,5 ml 0,1 M NaHCO3 bufor o pH 8,5 zawierającym 3% DMSO i zebrać eluat w 4 równoważnych frakcjach w probówkach o pojemności 2 ml.
- Oznaczyć stężenia białek w 4 frakcjach za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
- Przechowuj oznakowane białko w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
3. Test absorpcji z odczytem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)
- Dzień 1 – Zasień komórki
- Przemyć komórki BV-2 w kolbie, usuwając pożywkę hodowlaną i dodając 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
nuta: Objętość mycia będzie się różnić w zależności od wielkości użytej kolby komórkowej. Na przykład w przypadku kolby T175 przemyć 10 ml 1x PBS.
- Usunąć PBS z kolby i odłączyć komórki przez inkubację z kwasem trypsyna-etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) 0,05% w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do oderwania komórek od kolby (około 5 min).
nuta: Objętość trypsyny-EDTA 0,05% zależy od wielkości użytej kolby komórkowej. Na przykład w przypadku kolby T175 użyj 2 ml trypsyny-EDTA 0,05%.
- Ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej, pipetując w górę i w dół trzy do pięciu razy.
UWAGA: Objętość pożywki do hodowli różni się w zależności od wielkości użytej kolby komórkowej, a tym samym całkowitej liczby komórek w kolbie. Na przykład w przypadku kolby T175 użyj 8 ml pożywki hodowlanej.
- Policz komórki i utwórz zawiesinę komórkową o końcowym stężeniu 1 x 105 komórek/ml w pożywce hodowlanej zawierającej 200 μg/ml heparyny.
- Płytka: 250 μl zawiesiny komórkowej (2,5 x 104 komórki) na basenik w 96-dołkowej płaskiej płytce do hodowli tkankowej.
- Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Dzień 1 – Przygotowanie immunokompleksów
- Rozmrozić barwnik tau o pH na lodzie.
- Przygotować 65 μl na warunek 500 nM roztworu agregatów barwnikowo-tau pH w pożywce wolnej od surowicy (SFM) (DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełniony 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 200 μg/ml heparyny).
- Przygotować rozcieńczenia przeciwciał w 65 μl SFM w stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe. Wymieszaj agregaty barwnika pH-tau i przeciwciała w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U. Ostateczna objętość na warunek wynosi teraz 130 μl, a stężenie agregacji barwnika i tau pH wynosi 250 nM. Uszczelnić płytkę rozcieńczającą i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
- Dzień 2 – Wychwyt immunokompleksów
- Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek BV-2. Umyj komórki raz 100 μl temperatury pokojowej 1x PBS.
- Przenieś 125 μl immunokompleksów do komórek za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować komórki z immunokompleksami przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Usunąć pożywkę inkubacyjną z komórek i wyrzucić ją. Umyj komórki raz 100 μl temperatury pokojowej 1x PBS.
- Usuń 1x PBS i potraktuj komórki 50 μl trypsyny-EDTA 0,25% przez 20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Dodać 200 μl pożywki do hodowli i dobrze zawiesić, pipetując w górę i w dół, aby oddzielić komórki. Przenieś komórki na 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U. Płytka wirowa o gramaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Umieść płytkę na lodzie, usuń pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyj komórki, ponownie zawieszając granulki komórek w 150 μl lodowato zimnym 1x PBS. Płytka wirowa o gramaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Umieść komórki na lodzie, usuń dodany 1x PBS i umyj je, ponownie zawieszając granulki komórek w 150 μL zimnego buforu FACS (1x PBS, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 2 mM EDTA). Płytka wirowa o gramaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Umieść komórki na lodzie, usuń dodany bufor FACS i ponownie zawieś komórki w 200 μl zimnego buforu FACS.
- Natychmiast przeanalizuj próbki za pomocą FACS, uzyskując zdarzenia 2 x 104 w bramce żywych komórek (patrz krok 4.1).
