1. Oczyszczanie przeciwciał
UWAGA: Bufor równoważący dla przeciwciała wewnętrznego wynosi 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. Zastosowanym buforem elucyjnym jest 0,1 M kwas octowy. i żywica (białko A) są zależne od oczyszczonego specyficznego przeciwciała. Objętość kolumny jest równa wysokości łoża żywicy. Ilość zużytej fazy ruchomej jest określana w odniesieniu do objętości kolumny.
- Inicjalizacja systemu oczyszczania
- Otwórz oprogramowanie dołączone do systemu oczyszczania. Korzystając z instrukcji ręcznych, zrównoważyć kolumnę z buforem równoważącym przy natężeniu przepływu 2 ml/min przez 40 minut. Zatrzymaj bieg ręczny po zrównoważeniu.
- W kolektorze frakcji umieścić 15 ml stożkowych probówek w celu zebrania oczyszczonego eluatu przeciwciał i 50 ml stożkowych probówek w celu zebrania przepływu podczas przemywania o wysokiej zawartości soli. Upewnij się, że kolektor frakcji został zresetowany do pozycji początkowej, otwierając i zamykając kolektor frakcji przed rozpoczęciem cyklu. Kolektor frakcji jest utrzymywany w temperaturze 7 °C.
nuta: Kolektor frakcji można zresetować ręcznie w zakładce Kolektor frakcji w Ustawieniach, zarówno dla probówek 15 ml, jak i 50 ml.
- Wtrysk próbki
nuta: Pobrany płyn do hodowli komórkowych użyty w poniższych procedurach został uzyskany z komórek jajnika chomika chińskiego hodowanych w zautomatyzowanych mikrobioreaktorach.
- Dodać przefiltrowany płyn do hodowli komórek żniwnych o wielkości 0,22 μm do pustej strzykawki o pojemności 12 ml, której końcówka dyszy jest zakryta.
- Trzymając strzykawkę dyszą skierowaną w dół, włożyć tłok strzykawki, aż niewielka część tłoka znajdzie się w środku. Upewnij się, że płyn nie przecieka, obrócić strzykawkę dyszą skierowaną do góry i zdjąć nakrętkę.
- Nadal trzymając strzykawkę z dyszą skierowaną do góry, popchnij cylinder, aby rozproszyć powietrze, aż płyn do hodowli komórkowych znajdzie się na końcu dyszy. Włożyć dyszę strzykawki do portu do wstrzykiwań ręcznych w systemie oczyszczania i przekręcić, aby dokręcić.
- Dociskać tłok, aż cała próbka zostanie wstrzyknięta i będzie widoczna w dołączonej pętli próbki o dużej objętości 10 ml.
- Otwórz zapisany plik metody. Zapisz plik wynikowy w wymaganej lokalizacji i określ nazwę pliku po wyświetleniu monitu. Naciśnij przycisk run po wstrzyknięciu próbki do pętli próbki o dużej objętości.
- Uruchamianie metody oczyszczania
- Wybierz zapisaną metodę i kliknij przycisk Uruchom po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie urządzenia (krok 1.2.5).
nuta: System jest skonfigurowany do wykonywania następujących kroków. Użytkownik nie musi nic robić, gdy urządzenie jest uruchomione.
- Wyrównać kolumnę z trzema objętościami kolumny (CV) buforu równoważącego przy natężeniu przepływu 2 ml/min. Po wyrównaniu kolumny system, wykorzystując pętlę próbki o dużej objętości, wstrzyknie próbkę do kolumny z natężeniem przepływu 1 ml/min.
- Spadek sygnału UV przy 280 nm wskazuje, że próbka została zakończona podczas ładowania. Przemyć kolumnę buforem równowagowym przy natężeniu przepływu 2 ml/min, aż sygnał UV spadnie poniżej 25 mAU.
- Użyj czterech CV po 25 mM Tris z 1 M NaCl przy pH 7,5, aby przeprowadzić wtórne płukanie o wysokiej zawartości soli przy natężeniu przepływu 2 ml / min. Kolektor frakcji systemowej zbierze wszelkie białko/DNA, które wydostają się z kolumny podczas płukania solą, w probówkach o pojemności 50 ml.
- Zastosować pięć CV buforu elucyjnego o szybkości przepływu 1 ml/min w celu wymycia przeciwciała z kolumny. Zebrać eluat w probówkach o pojemności 15 ml na podstawie sygnału UV; gdy sygnał UV 280 jest powyżej 35 mAU, rozpoczyna się zbieranie; odbiór kończy się, gdy sygnał spadnie poniżej 50 mAU; Nazywa się to cięciem szczytowym.
nuta: Cięcie pików zapewnia normalizację profili elucji i unikanie ogonowania pików elucyjnych, które mogą zawierać agregaty białkowe.
- Przemyć kolumnę za pomocą trzech CV buforu równoważącego. Bieg kończy się po etapie mycia.
- Po elucji natychmiast zneutralizować oczyszczone białko za pomocą 1 M zasady Tris do pH ~5,5. Zmierzyć stężenie białka za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis przy 280 nm i 260 nm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
