Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
CZĘŚĆ 1: Tworzenie zdysocjowanych, płodowych, hipokampowych kultur neuronalnych gryzoni
1. Kroki przygotowawcze
- Powlekanie powierzchni galwanowych poli-L-lizyną (PLL) (3 dni przed rozwarstwieniem)
- Przygotować bufor boranowy, dodając 2,38 g kwasu borowego i 1,27 g boraksu do 500 ml wody destylowanej i mieszając przez 15 minut aż do rozpuszczenia. Pod kapturem wysterylizuj roztwór buforowy, filtrując (wielkość porów 0,2 μm), oznacz etykietą i przechowuj w temperaturze pokojowej (RT).
nuta: To rozwiązanie jest stabilne i może być używane przez 6 miesięcy.
UWAGA: Podczas przygotowywania buforu boranowego należy stosować zalecane środki ochrony osobistej.
- Przygotować roztwór podstawowy PLL (100 mg/ml), dodając 1 g PLL do 10 ml wody destylowanej i mieszając aż do rozpuszczenia. Przygotować 500 μl porcji roztworu podstawowego PLL. Aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mg/ml, dodać 500 μl podwielokrotności PLL do 50 ml buforu boranowego i wirować aż do rozpuszczenia, a następnie wysterylizować roztwór przez filtrowanie (wielkość porów 0,2 μm).
nuta: To rozwiązanie jest stabilne i może być używane przez 6 miesięcy.
- Przygotuj powierzchnie do powlekania. Używaj szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm do procedur barwienia immunologicznego i naczyń ze szklanym dnem do badań, które będą obejmować obrazowanie żywych neuronów. Jeśli używasz szkiełek nakrywkowych, przeprowadź autoklaw w autoklawie, a następnie umieść pięć szkiełek nakrywkowych w każdym naczyniu (o średnicy 3,5 cm).
nuta: Grubość szkiełka nakrywkowego wpływa na jakość i intensywność sygnału pozyskiwanych obrazów. Większość obiektywów mikroskopowych jest przeznaczona do szkiełek nakrywkowych #1.5. Wybierz odpowiednie szkiełka nakrywkowe zgodnie z konfiguracją i technikami obrazowania.
- Pod kapturem dodaj 1,5 ml roztworu PLL do każdego naczynia (naczynie ze szklanym dnem lub naczynie o średnicy 3,5 cm z pięcioma szkiełkami nakrywkowymi). Upewnij się, że wszystkie szkiełka nakrywkowe są zanurzone i przechowywane w RT przez 24 godziny.
- Na 2 dni przed sekcją odessać roztwór PLL i przemyć sterylną wodą wolną od endotoksyn, upewniając się, że szkiełka nakrywkowe są zanurzone. Trzymaj wodę w naczyniach i przechowuj w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
- Na 1 dzień przed rozbioru odessać wodę i zastąpić ją pożywką hodowlaną NB + B27 (patrz poniżej) i umieścić szalki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 24 godziny.
- Przygotowanie pożywki hodowlanej i roztworu podstawowego (1 dzień przed preparacją)
- Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): Do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g / l) bez L-glutaminy i czerwieni fenolowej dodaj 50 ml surowicy końskiej, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 ml L-glutaminy (200 mM), 10 ml pirogronianu sodu (100 mM), 10 ml penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml). Przefiltrować (wielkość porów 0,2 μm) i przechowywać w porcjach o pojemności 5 ml w temperaturze 4 oC ze szczelnie zamkniętą nakrętką.
nuta: To rozwiązanie jest stabilne i może być używane przez 1 miesiąc.
- Pożywka neuropodstawowa (NB) uzupełniona witaminą B27 (NB + B27): Do 50 ml pożywki NB bez czerwieni fenolowej dodać 1 ml suplementu witaminy B27.
- Pożywka Hibernate-E uzupełniona witaminą B27 (Hibernate + B27): Do 50 ml pożywki Hibernate-E dodaj 1 ml suplementu B27.
- Zewnątrzkomórkowy roztwór fizjologiczny (EPS): Do 1 l sterylnej wody dodać następujące składniki w określonych stężeniach końcowych: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N′-(kwas 2-etanosulfonowy) (HEPES, 10 mM), glukoza (20 mM) i CaCl2 (2 mM). Mieszać aż do rozpuszczenia i dostosować pH do 7,4, dodając NaOH (0,5 M) lub HCl (0,5 M). Pod maską wysterylizować przez filtrację (wielkość porów 0,2 μm) i przechowywać w temperaturze 4°C.
- Sprzęt i inne materiały laboratoryjne (dzień sekcji)
- Ustawić łaźnię wodną na temperaturę 37 °C. Podgrzać następujące porcje: 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) i 5 ml DMEM.
- Wysterylizuj następujące narzędzia, zanurzając je w zlewce zawierającej absolutny etanol (rysunek 1B): kleszcze, kleszcze zakrzywione, nożyczki, kleszcze drobno zakrzywione, kleszcze drobno proste, nożyczki chirurgiczne, kleszcze drobnokątowe i precyzyjne nożyczki sprężynowe.
nuta: Aby chronić narzędzia, umieść miękki materiał (np. chusteczki naukowe) na dnie zlewki.
- Napełnij dwie tace lodem i umieść następujące przedmioty.
- Tacka na lód 1 (ryc. 1C): Umieść narzędzia chirurgiczne w zlewce z absolutnym etanolem, zlewkę z HBSS do płukania narzędzi chirurgicznych, 10-centymetrową miskę z HBSS do umieszczenia zarodków, 6-centymetrową miskę z HBSS do umieszczenia głów zarodków oraz 6-centymetrową miskę z Hibernate + B27 do umieszczenia mózgów zarodków.
- Tacka na lód 2: Umieść 1 ml porcji trypsyny 2,5% i 3,5 cm naczynie z Hibernate + B27 dla wypreparowanego hipokampa.
nuta: Czas potrzebny na tę procedurę zależy od doświadczenia badacza i liczby zarodków do wypreparowania. Dlatego lód musi pozostać zamrożony przez wymagany czas. Do tego celu zalecane są tacki styropianowe.
2. Sekcja i siew (Rysunek 1)
- Izolacja hipokampa
nuta: Ciężarne szczury z zarodkami w 18. dniu zarodka (E18) są poddawane eutanazji bezpośrednio przed rozpoczęciem protokołu zgodnie z lokalną komisją etyczną Uniwersytetu w Barcelonie, zgodnie z europejskimi przepisami (2010/63/UE) dotyczącymi wykorzystywania i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi. W protokole tym jako metodę eutanazji zastosowano wdychanie dwutlenku węgla (CO2 ).
- Wypreparuj szczura na poziomie otrzewnej brzusznej za pomocą kleszczy i nożyczek. Pobrać macicę z zarodkami E18 i umieścić ją w 10-centymetrowym naczyniu, które zostało schłodzone na lodzie.
UWAGA: Ważne jest, aby uniknąć przyczepiania się włosów szczurów do zarodków. Zaleca się stosowanie dużych ilości 70% etanolu do sterylizacji jamy brzusznej. Począwszy od tego kroku, pracuj wewnątrz okapu na tacce na lód 1.
- Otwórz woreczki embrionalne i przenieś zarodki do 10-centymetrowej szalki z HBSS, upewniając się, że zarodki są całkowicie zanurzone.
- Usuń główkę zarodka nożyczkami i umieść ją w 6 cm naczyniu z HBSS. Powtórz ten proces ze wszystkimi zarodkami.
nuta: Aby uniknąć zanieczyszczenia, wszystkie tkanki z wyjątkiem główek zarodków należy wyrzucić do pojemnika z zakrętką.
- Przytrzymaj głowę zarodka drobno zakrzywionymi kleszczami i przebij oczodoły parą drobno prostych kleszczy, wchodząc pod kątem 45°, a następnie zwolnij drobno zakrzywione kleszcze.
nuta: Kleszcze nie mogą przechodzić przez mózg, dlatego ważne jest, aby zachować kąt podczas wchodzenia.
- Wypreparuj skórę i czaszkę nożyczkami chirurgicznymi, zaczynając od kości potylicznej do kości czołowej. Usuń mózg za pomocą pary drobno zakrzywionych kleszczy i umieść go w 6 cm naczyniu z Hibernate + B27. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie mózgi wyzdrowieją.
- Strzałkowo oddziel kresomózgowie za pomocą drobno prostych kleszczy.
nuta: Począwszy od tego etapu, sekcja hipokampa jest przeprowadzana pod mikroskopem stereoskopowym. Zaleca się stosowanie lamp przegubowych, tak aby światło oświetlało powierzchnię sekcji z boków. Zaleca się również użycie czarnego tła, ponieważ zapewnia to większy kontrast, co pozwala lepiej odróżnić hipokamp.
- Przygotuj naczynie o średnicy 10 cm, umieszczając krople Hibernate + B27 w odległości 1 cm (np. w kółku). Umieść jeden kresomózgowie na kroplę Hibernate + B27 i wizualizuj przez lunetę sekcyjną (zalecane jest powiększenie obiektywu 1,25x).
- Ostrożnie obierz opony mózgowe i usuń wzgórze, aby lepiej uwidocznić hipokamp.
- Rozetnij hipokamp precyzyjnymi nożyczkami sprężynowymi i umieść go w 3,5 cm naczyniu z Hibernate + B27 w tacce na lód 2. Powtarzaj dla każdego kresomózgowia, aż wszystkie hipokampy zostaną zebrane.
- Ostrożnie zbierz wszystkie hipokampy za pomocą pipety Pasteura i przenieś je do probówki o pojemności 50 ml.
nuta: Podczas zbierania hipokampów weź minimalną objętość hibernacji + B27, aby nie rozcieńczać trypsyny.
- Dysocjacja komórek
- Dysocjacja enzymatyczna hipokampa
- Do probówki o pojemności 50 ml zawierającej hipokamp dodaj 1 ml 2,5% trypsyny i doprowadź do objętości 5 ml za pomocą HBSS. Inkubować przez 15 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
- Aby rozcieńczyć trypsynę, dodać 10 ml wstępnie podgrzanego HBSS i inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
- Przenieś hipokampy, które teraz pojawiają się jako masa śluzowa, do probówki o pojemności 50 ml za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl, dodaj 6 ml wstępnie podgrzanego HBSS i inkubuj przez 5 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
- Mechaniczna dysocjacja hipokampa
- Przenieś masę do probówki o pojemności 2 ml ze stożkowym dnem, biorąc minimalną objętość. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM. Homogenizować granulki za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl, delikatnie zasysając w górę iw dół.
nuta: Bardzo ważne jest, aby unikać generowania pęcherzyków podczas zasysania, ponieważ pęcherzyki mogą powodować lizę komórek.
- Powtórz zasysanie w górę iw dół za pomocą wstępnie wyciągniętej szklanej pipety (10x-20x), tak aby jej końcówka stykała się ze stożkowym dnem probówki. Unikaj generowania bąbelków. Pod koniec tego kroku mieszanina musi być półprzezroczysta.
- Po jednorodnym wymieszaniu w taki sposób, aby mieszanina stała się przezroczysta, przenieść mieszaninę do probówki zawierającej 4 ml pożywki DMEM w temperaturze 37 °C i homogenizować szklaną pipetą, pipetując w górę i w dół.
- Wysiewanie komórek
- Policz komórki. Liczbę neuronów w roztworze można policzyć zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi.
nuta: W eksperymentach obrazowych do wykrywania przeciwciał i aktywności wapnia optymalne jest stężenie 50 000 komórek na 3,5 cm naczynia.
- Trzymając komórki w zawieszeniu, odjąć obliczoną objętość i umieścić na talerzu 3,5 cm naczynia zawierające szkiełka nakrywkowe pokryte PLL lub w naczyniach ze szklanym dnem pokrytych PLL.
- Równomiernie rozprowadź komórki na szalkach, delikatnie potrząsając skrzyżowanymi ruchami (w przód iw tył, a następnie z boku na bok; powtórz w razie potrzeby) i umieść szalki w inkubatorze CO2 (5%).
nuta: Ważne jest, aby używać ruchów skrzyżowanych, aby uniknąć osiadania komórek na obrzeżach naczynia.
- Co tydzień dodawaj około 1 ml NB + B27, aby kultura nie wyschła.
nuta: Po 2 tygodniach (14 dni in vitro [div]) neurony są dojrzałe i wyrażają wszystkie czynniki, które mają być wykorzystane do eksperymentów. Całkowita średnia liczba neuronów uzyskanych przy użyciu tego protokołu wynosi około 2,5 x 106 neuronów pochodzących ze średnio 12 zarodków E18 na ciężarną szczur.
CZĘŚĆ 2: Wykorzystanie kultur neuronalnych hipokampa do wykrywania przeciwciał w białkach powierzchniowych komórek nerwowych
UWAGA: Ta część protokołu pokazuje, jak kultury hipokampa są używane do identyfikacji przeciwciał anty-NMDAR w surowicy i/lub płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów z zapaleniem mózgu anty-NMDAR. Barwienie immunologiczne fluorescencyjne służy do wizualizacji reaktywności w żywych neuronach, ale można również zastosować inne metody wizualizacji. Odpowiednią kontrolą dla tego eksperymentu byłaby surowica lub płyn mózgowo-rdzeniowy od zdrowej osoby. W przypadku korzystania z próbek pobranych od ludzi należy pamiętać, że może być wymagana zgoda instytucjonalnej komisji etycznej.
3. Barwienie immunologiczne na żywo fluorescencyjne
- Użyj 14 komórek div, które zostały wyhodowane na szkiełkach nakrywkowych (50 000 komórek na 3,5 cm naczynie zawierające pięć szkiełek nakrywkowych).
- Wewnątrz kaptura spłukać szkiełka nakrywkowe NB podgrzanym do temperatury 37 °C.
- Dodać próbkę, która w tym przypadku zawiera przeciwciała anty-NMDAR (stosowane jako przeciwciało pierwszorzędowe) rozcieńczoną w pożywce NB w stosunku 1:200 dla surowicy lub 1:2 dla płynu mózgowo-rdzeniowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (wewnątrz inkubatora CO2 (5 %).
- Ostrożnie spłukać solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 3x w temperaturze pokojowej.
- Dodać roztwór utrwalający (4% formaldehydu w PBS) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
ostrożność: Podczas pracy z 4% formaldehydem należy pracować wewnątrz kaptura i nosić zalecane środki ochrony osobistej.
- Myć 3x PBS po 5 min.
- Dodać przeciwciało drugorzędowe Koza anty-ludzka AF488 w rozcieńczeniu 1:1000 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h,
nuta: Podczas inkubacji chronić przed nasłonecznieniem poprzez przykrycie folią aluminiową.
- Myć 3x PBS po 5 min. Spłucz wodą destylowaną
- Umieścić szkiełka nakrywkowe za pomocą płynnego medium mocującego (np. płynu montażowego zapobiegającego blaknięciu z DAPI; około 7 μl), odessać pozostałą ciecz i spłukać wodą destylowaną. Neurony są teraz gotowe do obrazowania fluorescencyjnego.
ostrożność: Podczas obchodzenia się z medium montażowym należy stosować zalecane środki ochrony osobistej.
