Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonane w okapie BSL2, chyba że zaznaczono inaczej. Miareczkowanie wirusa jest wymagane przed testem neutralizacji z redukcją blaszki miażdżycowej (PRN) w celu określenia optymalnego stężenia RSV stosowanego w teście PRN. Zaleca się podwielokrotnienie zapasów wirusa w małej objętości, która zostanie jednokrotnie rozmrożona i wykorzystana do każdego testu NAb. Zaleca się również stosowanie tego samego szczepu wirusa dla wszystkich testów NAb wykonanych dla wszystkich próbek z jednego badania. Upewnij się, że pożywki hodowlane i sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) są podgrzane w temperaturze 37 °C przed dodaniem ich do płytek komórkowych.
1. Miareczkowanie wirusa RSV
UWAGA: W zależności od liczby zapasów wirusa i liczby duplikatów, płytka testowa może być ustawiona zgodnie z Rysunkiem 1. Każdy zapas wirusa powinien być miareczkowany trzykrotnie na płytce testowej, zaczynając od najwyższego stężenia wirusa (tj. 1:10). Miareczkowanie seryjne może wynosić zazwyczaj 1:10. Procedury hodowli i utrzymania komórek A549 oraz hodowli RSV są wykonywane przy użyciu standardowych procedur i nie są objęte niniejszym protokołem.
- Talerze wysiewające (dzień 1)
- Ponownie zawiesić komórki A549 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagles (DMEM) + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 1000 IU penicyliny/streptomycyny (pióro/paciorkowca) przy 4 x 105/ml. Wysiewaj 96-dołkowe sterylne płytki z płaskim dnem o pojemności 100 μl/basenik, zawierające 4 x 104 komórki A459.
- Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla (CO2 ) (komórki będą w fazie logarytmicznej).
nuta: Należy użyć nowej fiolki z komórkami A549 po 23 przejściach. Zaleca się, aby nie rozpoczynać eksperymentów, gdy nowa fiolka z komórkami znajduje się jeszcze w pierwszych trzech pasażach.
- Zakażenie wirusem (dzień 2)
- Przygotowanie seryjnego rozcieńczania wirusa
- Szybko rozmrozić pojedynczą zamrożoną fiolkę z syncytialnym wirusem oddechowym (RSV) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do prawie całkowitego rozmrożenia i natychmiast umieścić na lodzie. Przygotować 3 kontrpróby dla każdego stada wirusa RSV, które ma być oznaczone, użyć początkowego rozcieńczenia zapasu wirusa w stosunku 1:10 ze 100 μl rozcieńczonego wirusa/basenika i zarezerwować co najmniej jedną kolumnę do kontroli ujemnej.
UWAGA: Rysunek 1 przedstawia kontrolę ujemną w trzech egzemplarzach.
- Dodać 100 μl każdego rozcieńczonego wirusa w stosunku 1:10 w trzech powtórzeniach rzędu A sterylnej płytki z 96-dołkowym dnem w kształcie litery U. Dodać 90 μl/basenik DMEM + 1000 j.m. długopisu/paciorkowca bez FCS do rzędów od B do H.
- Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:10 w dół płytki, przenosząc 10 μl z rzędu A do rzędu B. Wymieszać roztwór, pipetując zawartość w górę i w dół 5 razy i kontynuować dziesięciokrotne rozcieńczenia aż do rzędu H. Wyrzucić ostatnie 10 μl, tak aby końcowa objętość w każdym studzience wynosiła 90 μL.
UWAGA: Ważne jest, aby używać nowych końcówek do każdego rozcieńczenia.
- Inokulacja wirusa do komórek A549
- Pobrać płytkę (płytki) komórkowe A549 przygotowaną poprzedniego dnia. Upewnij się, że monowarstwy komórek A549 w płytkach 96-dołkowych są w ~ 80% zlewne. Wyrzuć nośnik, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając ją na sterylnym, chłonnym ręczniku papierowym.
- Umyj wszystkie studzienki dwukrotnie 100 μl PBS; wyrzuć nadmiar PBS, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając sterylny, chłonny ręcznik papierowy po każdym myciu. Nie dopuścić do wyschnięcia talerzy.
- Przenieść rozcieńczenia wirusa z płytki miareczkowania wirusa (rysunek 1) do odpowiednich studzienek na płytce komórkowej A549. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 1 godzinie inkubacji zdekantować supernatanty za pomocą pipety (aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego). Wyjmij 90 μl/studzienkę.
- Do każdej studzienki dodać 100 μL 1x pożywki 199 (M199, patrz tabela materiałów) + 1,5% sól sodowa karboksymetylocelulozy (CMC) o niskiej lepkości + 2% FCS zawierająca długopis/paciorkowiec.
UWAGA: 2x M199 + 4% FCS + 2% pen/strep i 3% CMC roztwory muszą być przygotowane i przechowywane w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Upewnij się, że roztwór jest podgrzany w temperaturze 37 °C przed dodaniem do talerzy.
- Przygotuj 2x roztwór M199: 1 saszetka/500 ml wody destylowanej + 20 ml FCS + 10 ml wstrzykiwacza/paciorkowca (do uzupełnienia 2x MI99). Przefiltruj roztwór za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm.
- W celu przygotowania 3% CMC, powoli dodawać 15 g CMC do 500 ml wody destylowanej. Rozpuścić CMC w wodzie za pomocą metalowego mieszadła w temperaturze 50 °C, co zajmuje około 1 godziny. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać 3% CMC i autoklawuj roztwór.
UWAGA: Ciało stałe CMC należy dodać do wody, która ma być rozpuszczona; Dodanie wody do suchej bryły tworzy "grudkę" ciała stałego, która jest bardzo trudna do rozpuszczenia.
- Przygotować 1x M199 + 1,5% CMC o niskiej lepkości + 2% FCS zawierający wstrzykiwacz/paciorkowiec, mieszając 1:1 2x M199 i 3% CMC przygotowanych w kroku 1.2.2.4.2.
- Inkubować płytkę przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Opracowanie płytki testowej i analiza (dzień 5)
- Utrwalanie i wywoływanie płytki testowej
- Odrzucić M199 + CMC + 2% FCS zawierające wstrzykiwacz/paciorkowiec, delikatnie odwracając płytkę. Dodawać powoli (aby nie naruszyć warstwy komórkowej) 200 μl buforu utrwalającego (80% acetonu, 20% PBS, przechowywanego w temperaturze -20 °C) w celu utrwalenia komórek. Inkubować w temperaturze -20 °C przez 20 minut.
- Wyrzuć bufor utrwalający i delikatnie osusz go na chłonnym ręczniku papierowym. Pozostaw talerz do wyschnięcia ekranem do dołu na 10 minut.
nuta: Od tego kroku test można przeprowadzić poza okapem BSL2.
- Przygotować 5% roztwór blokujący rozcieńczalnik do mleka w przefiltrowanym PBS zawierającym 0,05% polisorbatu 20 (PBS-polisorbat, patrz Tabela Materiałów). Obliczyć objętość potrzebną do zablokowania dla jednej płytki na podstawie 200 / studzienka i 110 dołków: 200 μl / studzienka x 110 dołków = 22 ml (1,1 ml skoncentrowanego rozcieńczalnika do mleka w 20,9 ml przefiltrowanego polisorbatu PBS). Na tym etapie należy również przygotować wystarczającą ilość roztworu blokującego dla przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Obliczyć objętość potrzebną dla każdego roztworu przeciwciała na jedną płytkę na podstawie 50 μl/studzienkę i 110 dołków: 50 μl/basenik x 110 dołków = 5,5 ml. W związku z tym całkowita objętość roztworu blokującego rozcieńczalnik do mleka wymagana do testu na pojedynczej płytce wynosi 33 ml.
- Dodać 200 μl/dołek roztworu blokującego. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut. Wylej roztwór, delikatnie odwracając płytkę i osusz chłonny ręcznik papierowy.
- Przygotować przeciwciało 1:500 Goat X RSV (mAb – przeciwciało pierwszorzędowe) rozcieńczone w roztworze blokującym. Dodać 50 μl/basenik roztworu mAb i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Umyj płytkę 3 razy przefiltrowanym polisorbatem PBS.
- Przygotuj 1:5 000 Alexa-Fluor anty-kozi IgG (przeciwciało drugorzędowe) rozcieńczone w roztworze blokującym. Dodać 50 μl/basenik roztworu przeciwciał drugorzędowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Umyj płytkę 5 razy przefiltrowanym polisorbatem PBS.
- Odczytać płytkę na automatycznym czytniku punktowym przy użyciu kanału izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i ustawień zliczania, jak pokazano na rysunku 2. Owinąć płytkę w folię i przechowywać w temperaturze 4 °C. Skalibrować przyrząd przy użyciu nieużywanej 96-dołkowej płytki hodowlanej i wprowadzić ustawienia zliczania przed testem.
nuta: W razie potrzeby możliwe jest ponowne skanowanie w ciągu kilku dni. Ustawienie kalibracji i zliczania można zapisać i wykorzystać do przyszłego skanowania, jeśli test wykorzystuje ten sam typ płytki, który został użyty do kalibracji.
- Sprawdź obrazy studzienek pod kątem płytek artefaktów lub uszkodzonych monowarstw komórkowych (ryc. 3). Wyklucz studzienki z przerwanymi monowarstwami komórek.
nuta: W zależności od wielkości tabliczek artefaktów może być konieczne ręczne zliczanie tych studni lub może być konieczne odrzucenie tych studni z analizy danych. Kryteria prawidłowego wyniku obejmują brak wykrytych uszkodzonych płytek jednowarstwowych lub artefaktów komórkowych w więcej niż jednym dołku replikacji oraz brak jednostek tworzących płytki (PFU) wykrytych w dołkach ujemnych (studzienkach bez dodatku wirusa).
- Określanie stężeń wirusa
- Wybierz dwa ostatnie rozcieńczenia, w których plamy można wyraźnie policzyć. Obliczyć średnią liczbę plamek z powtórzonych studzienek przy tym samym rozcieńczeniu. Obliczyć miano wirusa (PFU na ml) próbki podstawowej, korzystając z poniższego wzoru:
PFU/ml = średnia liczba blaszek/(współczynnik rozcieńczenia × objętość rozcieńczonego wirusa dodanego do studzienki)
nuta: Stężenie wirusa określone dla każdego stada RSV można teraz wykorzystać w teście PRN (krok 2).
2. Test neutralizacji RSV
- Talerze wysiewające (dzień 1)
- Ponownie zawieś komórki A549 w DMEM + 10% FCS + 1000 IU długopis/paciorkowiec przy 4 x 105/ml. Wysiewaj 96-dołkowe sterylne płytki z płaskim dnem o stężeniu 100 μl/basenik zawierające 4 x 104 komórki A459 i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (komórki będą w fazie logarytmicznej wzrostu).
nuta: Należy użyć nowej fiolki z komórkami A549 po 23 przejściach. Nie zaleca się stosowania komórek A549 przed pasażem numer 3.
- Przygotowanie wirusa i surowicy (dzień 2)
nuta: W zależności od rodzaju próbki wymagane są etapy wstępnego przetwarzania próbek przed testem NAb. Zaleca się stosowanie międzynarodowych standardowych surowic RSV, które są obecnie dostępne na żądanie w Narodowym Instytucie Norm Biologicznych i Kontroli (NIBSC).
- Przygotowanie rozcieńczenia surowicy
- Rozmrozić ludzką referencyjną surowicę odpornościową przeciwko RSV (surowicę referencyjną, REF) i próbki testowe surowicy w temperaturze pokojowej. Próbki surowicy inaktywowane termicznie i surowicę referencyjną w łaźni wodnej w temperaturze 56 °C przez 30 minut przed użyciem. Przygotować rozcieńczenia zgodnie z szablonem płytki (rysunek 4).
- Przygotować rozcieńczenie REF w stosunku 1:100. Przygotować co najmniej 110 μl REF rozcieńczonego w DMEM + długopis/paciorkowiec bez FCS na płytkę testową (np. 1,5 μl REF w całkowitej objętości 150 μL). Dodać 110 μl rozcieńczonego REF w stosunku 1:100 do dołka A12 sterylnej płytki z 96-dołkowym dnem w kształcie litery U.
- Dodać 55 μl DMEM + wstrzykiwacz/paciorkowiec bez FCS do studzienek B12 do H12 w kolumnie 12. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:2 w dół płytki, przenosząc 55 μl z rzędu A do rzędu B, mieszając roztwór przez pipetowanie zawartości w górę i w dół 5 razy i kontynuując do rzędu H. Odrzucić ostatnie 55 μl pożywki, tak aby końcowa objętość w każdym dołku wynosiła 55 μl. Do każdego rozcieńczenia należy stosować nowe końcówki.
- Przygotować próbki do badania surowicy w rozcieńczeniu 1:100. Ponieważ wszystkie próbki surowicy są oznaczane w trzech egzemplarzach, należy przygotować minimalną objętość 110 μl/basenik x 3 = 330 μl na próbkę testową surowicy.
- Dodać 110 μl każdej rozcieńczonej próbki testowej surowicy (1:100; S1 = surowica 1, S2 = surowica 2 itd.) do odpowiednich studzienek od A1 do A9, a także od E1 do E9 96-dołkowej sterylnej płytki zgodnie z rysunkiem 4.
- Dodać 55 μL DMEM + długopis/paciorkowca bez FCS do wszystkich studzienek oznaczonych X. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:2 zgodnie z krokiem 2.2.1.3 do rzędu D (dla próbek 1, 2 i 3). Odrzucić ostatnie 55 μl pożywki, tak aby końcowa objętość w każdym studzience wynosiła 55 μl. Podobnie przeprowadzić seryjne rozcieńczenia 1:2 dla próbek 4, 5 i 6 dla rzędów od E do H.
nuta: Konieczne jest stosowanie nowych końcówek do każdego rozcieńczenia.
- Dodać 55 μl DMEM + wstrzykiwacz/paciorkowiec bez FCS do studzienek w kolumnach 10 i 11.
- Przygotowanie wirusa
- Szybko rozmrozić pojedynczą zamrożoną fiolkę z RSV w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do prawie całkowitego rozmrożenia i natychmiast umieścić na lodzie.
- Rozcieńczyć wirusa w DMEM + długopisie/paciorkowca bez FCS w oparciu o stężenie podwielokrotności RSV określone w kroku 1.3.2. Zastosować rozcieńczenie, które daje około 200 PFU/studzienkę. Przygotuj całkowitą objętość 5,5 ml (na 100 dołków).
- Przygotowanie mieszaniny wirusa i surowicy
- Dodać 55 μl rozcieńczonego wirusa do wszystkich studzienek w kolumnach 1-9 i studzienek w rzędach E-H w kolumnach 10 i 11 (kontrola dodatnia) zgodnie z szablonem płytki (rysunek 4).
- Dodać 55 μl DMEM + długopis/paciorkowiec bez FCS do wszystkich studzienek w wierszach A-D kolumn 10 i 11 (kontrola ujemna). Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Inokulacja wirusa do komórek A549
- Przed zakończeniem okresu inkubacji pobrać płytkę (płytki) komórkowe A549 przygotowane w kroku 2.1.1. Upewnij się, że monowarstwy komórek A549 w płytkach 96-dołkowych są w ~ 80% zlewne.
- Wyrzuć nośnik, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając ją na sterylnym, chłonnym ręczniku papierowym. Umyj wszystkie studzienki dwukrotnie 100 μl PBS, wyrzuć nadmiar PBS, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając na sterylnym, chłonnym ręczniku papierowym po każdym myciu. Nie dopuścić do wyschnięcia talerzy.
- Przenieść 100 μl/basenik mieszaniny wirus-surowica do odpowiednich studzienek na płytce komórkowej A549 zgodnie z szablonem płytki. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Po 1 godzinie, za pomocą pipety, wyjąć 90 μL/studzienkę i dodać 100 μL podgrzanego 1x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + wstrzykiwacz/paciorkowiec. Inkubować płytkę przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
nuta: Upewnij się, że roztwór jest podgrzany w temperaturze 37 °C przed dodaniem do płytek.
- Opracowanie płytki testowej i analiza (dzień 5)
- Sporządzić płytkę mocującą i oznaczającą, wykonując czynności od 1.3.1.1 do 1.3.1.8.
- Określ 50% miano neutralizacji
- Oznaczyć 50% miano neutralizacji, obliczając proporcjonalną odległość między wzajemnymi rozcieńczeniami surowicy powyżej i poniżej 50% studzienek kontrolnych "bez surowicy" (dodatnia kontrola wirusa - kolumna 10, wiersze E-H).
- Policz liczbę PFU (tj. blaszek miażdżycowych) powstałych w wyniku poszczególnych infekcji wirusowych w studzienkach surowicy i bez studzienek kontrolnych surowicy. Obliczyć średnią liczbę PFU w studzienkach kontrolnych bez surowicy i określić wartość 50%.
- Zidentyfikować rozcieńczenia surowicy z liczbą bezpośrednio powyżej i poniżej 50% wartości studzienki kontrolnej bez surowicy. Korzystając z wykresu półlogarytmicznego lub szablonu arkusza kalkulacyjnego, wykreśl liczbę PFU na osi x (skala liniowa) i odwrotne rozcieńczenie surowicy na osi y (skala logarytmu10). Narysuj linię między tymi dwoma punktami i odczytaj z niej 50% miana neutralizacji próbek surowicy testowej.
