$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie bufora
- Bufor do znakowania (2x sól fizjologiczna buforowana fosforanami, (PBS), pH 7,9): W 400 ml destylowanej wody dejonizowanej (DD) dodać 100 ml 10x PBS, dostosować pH do 7,9 wodorotlenkiem sodu (NaOH).
- 3 mM biotyny: Rozpuść 1 mg biotyny w 588 μl buforu znakującego.
- 3 mM znacznika Sulfo: Rozpuść 150 nmol znacznika Sulfo w 50 μl buforu do znakowania.
- Bufor antygenowy (5% BSA): W 500 ml 1x PBS dodaj 25 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
- Przygotować 0,5 M roztwór kwasu octowego.
- 1,0 M buforu Tris-HCl pH 9,0: Przygotuj 1 M bufor Tris-HCl i dostosuj pH do 9,0 za pomocą HCl.
- Bufor powlekający (3% Bloker A): W 500 ml 1x PBS dodać 15 g Blockera A.
- Bufor do płukania (0,05 % Tween 20, PBST): W 5000 ml 1x PBS dodaj 2,5 ml Tween 20.
- Bufor odczytu (2x bufor do odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym): W 500 ml wody DD dodać 500 ml 4x buforu do odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym (tabela materiałów).
- Przechowuj biotynę i Sulfo-tag w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
nuta: Zarówno roztwory Biotyny, jak i Sulfo-znacznika powinny być zawsze świeżo przygotowane tuż przed procedurą etykietowania.
2. Oznacz autoantygen ludzkich wysp trzustkowych za pomocą biotyny i znacznika Sulfo
UWAGA: Wysokie stężenie antygenu, ≥0,5 mg/ml, jest zalecane dla bardziej efektywnej reakcji znakowania.
- Określ stosunek molowy ludzkiego autoantygenu wysp trzustkowych dla biotyny i znacznika sulfo.
- Liczbę molową antygenu należy uzyskać, dzieląc masę antygenu przez masę cząsteczkową.
- Dla antygenu o mniejszej masie cząsteczkowej (≤10 kd) należy zastosować stosunek molowy 1:5, a dla antygenu o większej masie cząsteczkowej (>50 kd) stosunek molowy 1:20.
- Oblicz objętość biotyny lub sulfo-znacznika, dzieląc liczbę molową przez jej stężenie.
- Wymieszaj ludzki autoantygen wysp trzustkowych z biotyną lub znacznikiem sulfo o stosunku molowym 1:5,
nuta: Białko w systemach buforowych tris lub glicyny powinno być zamienione na bufor 2x PBS o pH 7,9 przy użyciu kolumny wirowej do sortowania.
- Ponieważ Biotyna i Sulfo-tag są wrażliwe na światło, przykryj probówki reakcyjne folią aluminiową. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.
- Podczas inkubacji należy zalać kolumnę wirową, trzykrotnie dozując 2x bufor PBS do kolumny. Odwirować roztwór o stężeniu 1000 x g przez 2 minuty za każdym razem.
nuta: Obecnie reakcja etykietowania, polegająca na mostkowaniu, nadal występuje i musi zostać zatrzymana.
- Zatrzymaj reakcję znakowania, oczyszczając znakowany autoantygen ludzkich wysp trzustkowych. Aby oczyścić, przepuścić autoantygen przez kolumnę wirową i odwirować kolumnę przy 1000 x g przez 2 minuty.
- Oznaczyć znakowane stężenie antygenu (μg/μL) na podstawie ilości białka antygenowego i objętości końcowej.
nuta: W przybliżeniu będzie 90 - 95% retencji znakowanego antygenu po każdym przejściu kolumny wirowej.
- Podwielokrotnić znakowany antygen i przechowywać znakowany antygen w temperaturze -80 °C.
3. Zdefiniuj najlepsze stężenia i proporcje dla dwóch znakowanych antygenów do testu (test Checker Board)
- Przygotować dwie próbki surowicy, jedną wysoce dodatnią i jedną ujemną, o całkowitej objętości 200 μl dla każdej.
- Podaniec 4 μl surowicy i dodawać 1x PBS, aż końcowa objętość wyniesie 20 μl na studzienkę dla 96-dołkowej płytki do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Użyć połowy płytki dla próbki o wysokim dodatnim wyniku, a drugiej połowy dla próbki ujemnej, jak pokazano na rysunku 1A.
- Dodać 10 μl biotyny i 10 μl antygenu znakowanego sulfoznacznikiem i przeprowadzić seryjne rozcieńczenia dla dwóch różnie znakowanych antygenów, jak pokazano na rysunku 1A. Uruchomić poziome rozcieńczenie szeregowe dla jednego znakowanego antygenu i pionowe rozcieńczenie szeregowe dla drugiego znakowanego antygenu.
- Kontynuować pozostałe etapy oznaczania opisane w ppkt 5.3–9.1.
- Obliczyć stosunek sygnałów z próbki o wysokim poziomie dodatnim do każdego z odpowiadających im sygnałów z próbki ujemnej pokazanej na rysunku 1B.
- Zidentyfikuj najlepsze stężenia antygenów znakowanych biotyną i sulfo, wybierając punkt o najwyższym lub prawie najwyższym stosunku dodatnim do ujemnego. Weź pod uwagę niski sygnał tła z próbki ujemnej, aby określić stosunek.
nuta: Dzień testu 1 obejmuje etapy od 4 do 6.
4. Przygotuj bufor antygenowy, używając odpowiedniego stężenia antygenu znakowanego biotyną/sulfoznacznikiem
- Wybierz racjonalne stężenie każdego antygenu na podstawie testu szachownicy.
- Przygotować 3 ml roztworu antygenu na płytkę, stosując racjonalne stężenie antygenu znakowanego biotyną/sulfoznacznikiem dla buforu antygenowego.
5. Inkubuj próbki surowicy z oznakowanym antygenem
UWAGA: W tej sekcji są dwa protokoły, jeden bez leczenia kwasem w surowicy, a drugi z leczeniem kwasem w surowicy. Wszystkie testy autoprzeciwciał przeciwko wyspom trzustkowym, z wyjątkiem testu autoprzeciwciał przeciwko insulinie (IAA), wykorzystują zwykły protokół bez leczenia kwasem w surowicy od kroków 5.1 do 5.5, podczas gdy test IAA pomija te kroki i stosuje protokół z leczeniem kwasem w surowicy od kroków 5.6 do 5.9.
- Podaniec 4 μl surowicy i dodawać 1x PBS, aż ostateczna objętość wyniesie 20 μl na basenik dla 96-dołkowej płytki PCR.
- Dodać 20 μl znakowanego roztworu antygenu do dołka.
- Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.
- Umieść płytkę na wytrząsarce (niska prędkość) przy RT na 2 godziny.
- Umieścić płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C i inkubować przez noc (18 - 24 h).
nuta: Poniższy protokół kroków od 5.6 do 5.9 jest przeznaczony tylko dla testów IAA i innych testów autoprzeciwciał, pomiń te kroki.
- Zmieszać 15 μl surowicy z 18 μl 0,5 M kwasu octowego dla każdej próbki surowicy. Inkubować tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
- Przygotować roztwór antygenu o racjonalnym stężeniu antygenu znakowanego biotyną i sulfoznacznikiem, w oparciu o test szachownicy, używając buforu antygenowego. W każdym dołku podwielokrotność 35 μl buforu antygenowego, zawierającego biotynę i antygen znakowany sulfoznacznikiem, na nową płytkę PCR.
- Przed zakończeniem 45-minutowej inkubacji (etap 5.6) dodać 8,3 μl 1 M buforu Tris pH 9,0 z boku każdej studzienki na płytce antygenowej (krok 5.6). Ważne jest, aby ograniczyć mieszanie się buforu Tris z antygenem. Natychmiast przenieść 25 μl surowicy, którą w kroku 5.6 potraktowano kwasem, do każdej studzienki i wymieszać roztwór. Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.
- Umieść płytkę na wytrząsarce (niskie obroty) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Umieść płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C i pozostaw płytkę do inkubacji przez noc (18 - 24 godziny).
6. Przygotuj płytkę ze streptawidyną
- Wziąć płytkę ze streptawidyną z lodówki o temperaturze 4 °C i pozostawić ją do zamontowania w temperaturze RT.
- Gdy płytka streptawidyny znajdzie się w temperaturze pokojowej, dodaj 150 μl 3% blokera A do każdej studzienki.
- Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą.
- Inkubować płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.
UWAGA: Dzień testu 2 obejmuje etapy od 7 do 9.
7. Przenieś surowicę/antygen inkubowany na płytkę streptawidyny
- Następnego dnia wyjmij płytkę ze streptawidyną z lodówki i wyrzuć bufor z płytki. Rozłóż na stole suche ręczniki papierowe i postukaj talerzem do góry nogami, aż w studzienkach nie będzie już bufora.
- Napełnij pustą płytkę streptawidyny 150 μl PBST na studzienkę i wyrzuć PBST z płytki, co daje łącznie trzy prania.
- Przenieść 30 μl inkubacji surowicy/antygenu na dołek do płytki streptawidyny.
- Przykryj talerz folią, aby uniknąć światła. Potrząsaj płytką na niskim poziomie w temperaturze RT przez 1 godzinę.
8. Umyj płytkę i dodaj bufor do odczytu
- Wyrzuć inkubatory z płytki. Dodać 150 μl PBST do dołka i wyrzucić PBST z płytki, w sumie trzy prania.
- Po umyciu dodać 150 μl do studzienki buforu odczytowego.
nuta: Ważne jest, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w roztworze, ponieważ wpłynie to na sposób odczytu płytki na czytniku płyt.
