1. Tworzenie biofilmu C. tropicalis
- Przygotować biofilmy Candida w 96-dołkowej płaskodennej płytce do mikromiareczkowania z polistyrenu, jak opisano wcześniej (ryc. 1).
- Dodać 100 μl kultury C. tropicalis (z 10 6 komórek/ml bulionu, przygotowanego jak wyżej) do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania za pomocą pipety wielokanałowej (ryc. 2A). Zachowaj dwie ostatnie kolumny (11 i 12) jako kontrole ujemne "bez grzyba plus surowica" i "bez grzyba i bez surowicy", nie dodając komórek grzyba. Wypełnić kolumny 11 i 12 100 μl samego roztworu kwasu morfolinepropanosulfonowego (MOPS) Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
- Przykryj płytkę do mikromiareczkowania pokrywką i folią aluminiową. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w warunkach stacjonarnych.
- Następnego dnia ostrożnie odessać pożywkę za pomocą pipety wielokanałowej (bez dotykania i przerywania biofilmów). Delikatnie postukaj w płytkę w pozycji odwróconej o bibułę, aby usunąć resztki nośnika.
- Umyć płytkę 200 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (na dołek) za pomocą pipety wielokanałowej. Dodać PBS bardzo delikatnie wzdłuż bocznych ścian studzienki, aby uniknąć przerwania biofilmu. Ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety wielokanałowej. Powtórz pranie PBS 2x (w sumie trzy prania).
- Aby usunąć nadmiar PBS, należy wysuszyć płytkę na powietrzu (bez pokrywki) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Leczenie biofilmu za pomocą przeciwciał
UWAGA: Biofilmy mogą być teraz przetwarzane w celu oceny zahamowania dojrzewania biofilmu przez przeciwciała. Jako źródło przeciwciał poliklonalnych wykorzystano surowicę mysie. Różne grupy myszy immunizowanych Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis i Sap2-parapsilosis) wraz z myszami immunizowanymi pozorowo wykrwawiono za orbitalnie i izolowano surowicę. Obecność przeciwciał anty-Sap2 potwierdzono za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) specyficznego dla Sap2.
- Przed użyciem przeprowadzić inaktywację termiczną surowicy (źródła przeciwciał poliklonalnych) w temperaturze 56 °C przez 30 minut, aby wykluczyć rolę dopełniacza w aktywności hamującej. Inaktywuj serum na gorąco przed rozcieńczeniem surowicy.
nuta: Użyj surowicy od myszy pozorowanych, myszy przedimmunologicznych i surowicy zubożonej w przeciwciała Sap2 jako dodatkowe kontrole. Surowicę zubożoną w przeciwciała przygotowano zgodnie z poprzednim badaniem. Wśród seryjnych rozcieńczeń (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 i 1:12,800) dla surowicy badanej w tym protokole, zahamowanie dojrzewania biofilmu obserwowano w 1:25, 1:50 i 1:100; W związku z tym wybrano 1:50, aby zachować równowagę między hamowaniem a spożyciem surowicy.
- Przygotować seryjne rozcieńczenia próbek surowicy inaktywowanej termicznie w sterylnym pożywce RPMI 1640 MOPS (1:50). Stosować wspólne rozcieńczenie surowicy (1:50) dla wszystkich próbek surowicy, które mają być badane pod kątem zahamowania dojrzewania biofilmu.
- Dodać 100 μl wybranego rozcieńczenia surowicy do każdego dołka 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Dla każdej próbki dodać rozcieńczenia surowicy po kolei, zgodnie z załączonym układem (Rysunek 2B).
- W kolumnie 10 nie dodawać rozcieńczenia surowicy; dodać tylko pożywkę RPMI 1640 MOPS do kontroli pozytywnej tylko na obecność grzyba.
nuta: Kolumna 10, rzędy G1-G8 i H1-H8 początkowo miały komórki grzybów w RPMI-MOPS. Jednakże, podczas gdy RPMI-MOPS został dodany do kolumny 10 nawet po 24 godzinach, wiersze G1-G8 służyły jako kontrola PBS, a wiersze H1-H8 jako kontrola bez surowicy po 24 godzinach.
- W kolumnie 11 dodać rozcieńczenie surowicy w stosunku 1:50 do wszystkich studzienek, aby służyły jako kontrola ujemna surowicy bez grzyba i surowicy.
- W kolumnie 12 nie dodawać rozcieńczenia surowicy do żadnego studzienka; zachowaj to jako kontrolę ujemną bez grzybów i surowicy.
- Przykryj talerz pokrywką i folią aluminiową. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
3. Oszacowanie aktywności metabolicznej biofilmu
- Następnego dnia ostrożnie odessaj surowicę za pomocą pipety wielokanałowej (bez dotykania i przerywania biofilmu). Delikatnie postukaj w płytkę w pozycji odwróconej o bibułę, aby usunąć resztki surowicy.
- Przemyć płytkę 200 μl 1x PBS (na studzienkę) za pomocą pipety wielokanałowej, dodając PBS wzdłuż bocznych ścianek studzienki, aby uniknąć przerwania biofilmu. Ostrożnie odessać PBS za pomocą pipety wielokanałowej i powtórzyć płukanie PBS 2x (w sumie trzy płukania). Suszyć płytkę na powietrzu (bez pokrywki) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby wysuszyć nadmiar PBS.
- Preparat XTT(2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-2H-tetrazolino-5-karboksyanilidu)/menadionu:
- Preparat XTT należy przygotować w sterylnym mleczanie Ringers w postaci roztworu o stężeniu 0,5 g/l. Rozpuścić 25 mg XTT w 50 ml sterylizowanego przez filtr mleczanu Ringersa. Podaniec 10 ml w oddzielnych probówkach pokrytych folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Przygotuj menadione jako zapas 10 mM. Rozpuścić 8,6 mg menadionu w 5 ml acetonu i rozprowadzić 50 μl w 100 oddzielnych mikroprobówkach. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
- Przygotuj roztwór XTT/menadionu tuż przed użyciem, biorąc 10 ml XTT i dodając 1 μl menadionu, aby uzyskać 1 μM roztwór roboczy.
- Dodać 100 μl roztworu XTT/menadionu do dołka 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Przykryj talerz pokrywką i folią aluminiową. Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w ciemności.
- Przenieść 80 μl barwnego supernatantu z każdej studzienki do świeżej płytki 96-dołkowej. Odczyt płytki przy długości fali 490 nm.
- Obliczyć średnią wartości absorbancji studzienek w kolumnie 10 (kontrola dodatnia tylko w odniesieniu do grzybów), która posłuży jako wartość odniesienia do obliczenia procentowego zahamowania biofilmu przez każdą próbkę surowicy, stosując równanie (1).
% zahamowania biofilmu = 100 - 
× 100 (1)
