Oparta na immunofluorescencji metoda wizualizacji komórek kępek w kriosekcjach jelita drogowego

Abstract

Źródło: Mizutani, Y. et al., Zastosowanie przeciwciał antyfosfogirdynowych do wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach mysiego jejunum.J. Vis. Exp. (2018)

Ten film ilustruje opartą na immunofluorescencji metodę wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach jelita czczego myszy. W obrębie kosmków jelitowych kolokalizacja zielonej fluorescencji na końcu światła z wydłużoną masą czerwonych korzonków wskazuje na obecność komórek kępkowych.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowania

1. Przygotować 10 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS): 32,27 g wodorofosforanu sodu (Na₂HPO₄·12H2O), 4,5 g diwodorofosforanu sodu (NaH₂PO₄·2H₂O), 80,0 g chlorku sodu (NaCl) dodanego do wody ultraczystej do końcowej objętości 10 l. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
2. Przygotować 200 ml PBS-T: 200 ml PBS z etapu 1.1 ze 100 μl eteru polioksyetylenofenylowego (10) oktylofenylowego do końcowego stężenia 0,05% (obj. obj.). Sklep w RT.
3. Nosząc rękawice i ochronę oczu, przygotuj 50 ml 15% sacharozy w 10% buforowanym obojętnym roztworze formaliny: 7,5 g sacharozy dodać do 10% buforowanego obojętnego roztworu formaliny (tabela materiałów) do końcowej objętości 50 ml. Przechowywać w RT.
   ostrożność: Wdychanie i/lub kontakt ze skórą/oczami z formaldehydem w 10% buforowanym neutralnym roztworze formaliny może być niebezpieczne. Obchodź się ostrożnie.
4. Przygotować 1,5 ml roztworu podstawowego sprzężonego z barwnikiem falloidyną i fluorescencyjnym 200 jednostek: koniugat farby falloidynowo-fluorescencyjnej (300 jednostek w 1 fiolce, liofilizowane ciała stałe, długości fal wzbudzenia i emisji: odpowiednio 581 nm i 609 nm) zawieszone w 1,5 ml metanolu. Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.
5. Przygotować 5 mg/ml roztworu podstawowego dichlorowodorku 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI): 10 mg DAPI w 2 ml N, N-dimetyloformamidu (DMF). Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.
6. Przygotować 5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS: 0,5 g BSA, 10 ml PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
7. Usuń ściętą końcówkę prostej igły o rozmiarze 18 za pomocą szczypiec i ściśnij ściśnięty koniec szczypcem w kierunku wzdłużnym, aby umożliwić przepływ cieczy przez światło igły (Rysunek 1A1).
   nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Sekcja zwierząt i izolacja Jejunum

1. Fiksacja perfuzyjna myszy
   1. Noś rękawice i pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
   2. Przygotuj szklaną zlewkę o pojemności 100 ml, 10% buforowany neutralny roztwór formaliny, narzędzia chirurgiczne (nożyczki, kleszcze), metalową tackę, nylonowe szwy 6-0, prostą igłę 18 G przygotowaną jak w 1,7, igłę skrzydełkową 22G, strzykawkę 20 ml.
   3. Załadować 20 ml 10% buforowanego neutralnego roztworu formaliny ze szklanej zlewki do strzykawki o pojemności 20 ml i przymocować igłę skrzydełkową o rozmiarze 22 do wylotu.
   4. Przygotuj płynną żelatynę, dodając 1 g żelatyny w proszku do 20 ml PBS (końcowe 5% żelatyny) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Po namoczeniu w temperaturze pokojowej przez 15 minut, inkubować w temperaturze 50 °C w łaźni wodnej przez 15 minut bez wstrząsania.
   5. Krótko wirować i inkubować w temperaturze 50 °C przez kolejne 15 minut, aby całkowicie rozpuścić żelatynę. Pozostaw tubkę w pozycji RT do czasu użycia.
   6. Poddaj eutanazji dorosłą mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
   7. Umieść mysz z kroku 2.1.6 na metalowej tacy i wykonaj małe nacięcie na skórze przez chrząstkę za pomocą narzędzi chirurgicznych.
   8. Rozszerz nacięcie obiema rękami, aby odsłonić okolice klatki piersiowej i brzucha.
   9. Otwórz otrzewną, aby odsłonić membranę, a następnie otwórz przeponę po obu stronach.
   10. Przeciąć klatkę piersiową wzdłuż przednich linii pachowych po obu stronach, a następnie usunąć ścianę klatki piersiowej, przecinając w kierunku poprzecznym w miejscu grasicy, aby odsłonić serce.
   11. Wykonaj małe nacięcie na małżowinie usznej prawego przedsionka, aby odprowadzić krew i włóż igłę ze skrzydłami o rozmiarze 22 do wierzchołka lewej komory. Nacisnąć tłok, aby przetworzyć tkanki 10% buforowanym roztworem neutralnej formaliny.
   12. Po odsłonięciu narządów w miednicy odetnij koniec odbytnicy od odbytu i oddziel jelita od ciała, przecinając krezkę.
   13. Aby wyizolować jelito czcze, przetnij jelita na 4 cm od antrum żołądka od strony odbytu. Wyrzuć odbytową połowę pozostałego jelita cienkiego.
   14. Przytnij jelito czcze na pół, aby ułatwić procedurę spłukiwania. Załaduj 20 ml 10% buforowanego neutralnego roztworu formaliny do strzykawki o pojemności 20 ml i przymocuj prostą igłę o rozmiarze 18 przygotowaną w kroku 1.7 do wylotu.
   15. Wstrzyknąć 10% buforowany obojętny roztwór formaliny z jednego końca przyciętego jelita czczego, aby wypłukać treść jelitową i utrwalić powierzchnię światła jelita (ryc. 1A2).
   16. Przemyć światło jelita, wstrzykując PBS zgodnie z opisem w kroku 2.1.15.
   17. Przepłukać płynną żelatynę do światła jelita zgodnie z opisem w kroku 2.1.15, aby zastąpić PBS płynną żelatyną.
   18. Zamknij jeden koniec przyciętego jelita czczego przez podwiązanie szwem za pomocą nylonowego szwu 6-0, wypełnij jelito czcze płynną żelatyną i zamknij przeciwległy koniec przez podwiązanie szwem (ryc. 1A3).
   19. Dodaj cztery węzły szwów, aby dopasować przekrój jelita czczego w kształcie kiełbasy do wklęsłej części kriomoldu (ryc. 1A4).
       nuta: W przypadku krioform o przekroju wklęsłym 20 mm x 25 mm x 5 mm preferowany jest przekrój jelita czczego przypominający kiełbasę ~20 mm.
   20. Namocz tkanki w 50 ml 15% sacharozy w 10% buforowanym roztworze neutralnej formaliny przez noc w temperaturze 4 °C.
       nuta: Etapy te zapewniają krioochronę poprzez wiązanie sacharozy i białek przez formalinę żelatyny i tkanki. Żelatyna żelatyna żelatyna w formalinie nie topi się w temperaturze pokojowej, podczas gdy żelatyna żelatyniowana bez utrwalenia w temperaturze 4 °C topi się w temperaturze pokojowej.

3. Błyskawiczne zamrażanie wypełnionych żelatyną tkanek Jejunum

1. Przecinając jelito czcze na węzłach szwu, uzyskuje się trzy kawałki jelita czczego przypominające kiełbasę z podwiązanymi obydwoma końcami (ryc. 1A4). Wyrównaj kawałki przypominające kiełbasę w kriomold w celu dodania związku do zatapiania w celu przygotowania zamrożonych próbek tkanek.
2. Zamroź kriomold w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem. Przechowywać krioformy w temperaturze -80 °C
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Immunofluorescencja komórek kępki za pomocą swobodnie pływających kriosekcji

1. Kriosekcja
   1. Ustaw zarówno temperaturę komory kriostatu (CT), jak i temperaturę obiektu (OT) na -22 °C. Umieść zamrożony blok tkanki w kriofordzie w komorze kriostatu na co najmniej 15 minut.
   2. Dodać 3 ml PBS do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego.
   3. Usuń zamrożony blok tkanki z kriomoldu i przetnij go na pół żyletką, aby odsłonić poprzeczny przekrój jelita czczego. Zamontuj połowę bloku na uchwycie (adapterze do kriostatu), aby przeciąć płaszczyznę cięcia za pomocą żyletki.
   4. Jelito czcze wypełnione żelatyną podzielić na odcinki o grubości 30 μm. Za pomocą zamrożonych kleszczy delikatnie przenieś skrawki do 35-milimetrowej płytki hodowlanej przygotowanej w kroku 4.1.2 (Rysunek 2B, po prawej).
2. Zastosowanie przeciwciał pierwszorzędowych
   1. Umyć swobodnie pływające sekcje w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm 3 razy po 5 minut za pomocą 3 ml PBS-T, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce przeciwstawnej (około 36 razy/min).
   2. Przygotować roztwór do pobierania antygenu: 0,3 ml koncentratu roztworu do pobierania antygenu (tabela materiałów) w 2,7 ml ultraczystej wody. Dodać 3 ml roztworu do pobierania antygenu do 35-milimetrowej płytki hodowlanej zawierającej swobodnie pływające sekcje.
   3. Zamknąć pokrywę, uszczelnić szczelinę między naczyniem a pokrywką paskiem taśmy winylowej i inkubować w temperaturze 50 °C w inkubatorze do hybrydyzacji przez 3 godziny bez wstrząsania.
   4. Wyjąć naczynie z inkubatora i schłodzić w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po usunięciu taśmy winylowej umyj sekcje 3 razy po 5 minut każdy 3 ml PBS-T i delikatnie potrząśnij.
   5. Zassać PBS-T i dodać 5 kropli roztworu blokującego (Tabela materiałów) na sekcje. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, lekko wstrząsając.
   6. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego: 495 μl 5% BSA w PBS z 5 μl przeciwciał fosfo-Y1798 girdyny (pY1798) (tabela materiałów). Dodać 500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na skrawki (nie trzeba usuwać roztworu blokującego).
   7. Umieścić naczynie w wilgotnej komorze inkubacyjnej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, lekko wstrząsając.
      nuta: Nocną inkubację można przedłużyć do trzech nocy.
3. Zastosowanie przeciwciał drugorzędowych
   1. Umyj sekcje 3 razy po 5 minut w 3 ml PBS-T delikatnie wstrząsając.
   2. Przygotować rozcieńczony roztwór podstawowy DAPI: 2 μl roztworu podstawowego DAPI (krok 1.5), 998 μl PBS.
   3. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego: 476 μl 5% BSA w PBS, 10,5 μl rozcieńczonego roztworu DAPI, 12,5 μl sprzężonego roztworu podstawowego z barwnikiem falloidynowym i fluorescencyjnym, 1 μl koniugatu koziego barwnika anty-króliczego IgG-fluorescencyjnego (długość fali: wzbudzenie 496 nm, emisja 520 nm).
   4. Po zaessaniu PBS-T nanieść drugorzędowy roztwór przeciwciała i inkubować w komorze inkubacyjnej z osłoną światła w temperaturze pokojowej przez 30 minut z łagodnym wstrząsaniem.
   5. Umyj sekcje 3 razy po 5 minut za pomocą 3 ml PBS-T i delikatnie wstrząsając.
   6. Po ostatnim umyciu usuń PBS-T i zastąp go 3 ml PBS bez eteru polioksyetylenofenylowego(10) oktylofenylowego. Przenieś naczynie do mikroskopu stereoskopowego.
   7. Umieścić 200 μl PBS w kropli na środku szkiełka z białego szkła pokrytego MAS i przenieść jeden odcinek jelita czczego z naczynia do kropli za pomocą końcówki do pipety P200.
   8. Po wyregulowaniu wyrównania przekroju pod mikroskopem stereoskopowym, odessać wszystkie pozostałe PBS otaczające przekrój.
   9. Dodać 20 μl wodnego podłoża montażowego i umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 20 x 20 mm na wierzchu podłoża.
   10. Natychmiast uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego środkami montażowymi na bazie ksylenu. Umieść szkiełko na drewnianej mapie i pozwól, aby media montażowe na bazie ksylenu zastygły w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny.
       nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Po zestaleniu się nośników montażowych na bazie ksylenu szkiełka można przechowywać przez 2 - 3 tygodnie w osłoniętej światłem skrzynce na suwaki w temperaturze pokojowej.

5. Mikroskopia konfokalna

1. Nałóż olejek immersyjny na obiektyw 63X mikroskopu konfokalnego. Obróć szkiełko nakrywkowe w dół i umieść szkiełko na stoliku.
2. Digitalizacja obrazów TC uzyskanych na długościach fal lasera 405, 488 i 555 nm i zapisywanie obrazów w formacie tiff (.tiff).
   nuta: Wybierz zestaw filtrów detekcyjnych, który jest odpowiedni dla barwników fluorescencyjnych (tj. maksima wzbudzenia/emisji: 358/461 nm, 490/525 i 590/617).

Results

Rycina 1: Żelatynowe wypełnienie skrawków jelita czczego w celu morfologicznego zachowania kriosekcji
(A) Fotografie procedur śródświetlnego wypełniania mysiego jelita czczego żelatyną. (A1) Ścięta końcówka prostej igły o rozmiarze 18 została usunięta aby uniknąć przebicia ściany jelita. (A2) Buforowany obojętny roztwór formaliny (10%) wstrzykn...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slc:DDY 6-tygodniowe samice myszy	Chubu Kagaku Shizai	Nie dotyczy
12-wodny wodorofosforan disodowy (Na2HPO412H2O)	Wako	Numer katalogowy: 196-02835
Dihydroenfosforan sodu dwuwodny (NaH2PO42H2O	Wako	Numer katalogowy: 199-02825
Chlorek sodu (NaCl)	Wako	199-10665
Triton X-100, eter oktylofenylowy polioksyetylenowy(10)	Katayama Chemiczny	Nie dotyczy
sacharoza	Wako	Numer katalogowy: 190-00013
10% buforowany neutralny roztwór formaliny	Muto Chemiczny	Rok 20215	Krok 1.3.
Koniugat falloidyny-barwnika fluorescencyjnego, falloidyna Alexa Fluor 594	ThermoFisher Naukowy	A12381
metanol	Nacalai Tesque	21915-35
DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał D1306
N.N-dimetyloformamid (DMF)	Nacalai Tesque	Numer katalogowy 13015-75
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A9647-10G
Prosta igła ze stali nierdzewnej o rozmiarze 18 mm	Terumo (Ziemia)	NN-1838R
U.S.P. 6-0, szew nylonowy 60 cm, Crownjun	Kono Seisakusho powiedział:	Nie dotyczy
Igła skrzydełkowa o rozmiarze 22	Terumo (Ziemia)	Zobacz materiał SV-22DLK
Strzykawka 20 ml TERUMO	Terumo (Ziemia)	Zobacz materiał SS-20ES
Probówka wirówkowa 50 ml	TPP (TPP)	Numer katalogowy: 91050
15 ml probówek wirówkowych Iwaki	Iwaki powiedział:	2325-015
Mikroprobówka 1,5 ml	gwiazda	Przekaźnik RSV-MTT1.5
Żelatyna w proszku, Gelare-blanc	Laboratorium biologiczne Nitta	Numer katalogowy: 2809
Związek do zatapiania zamrożonej próbki tkanki, związek O.C.T. 118 ml 12 sztuk	Sakura FineTech	Numer katalogowy: 4583
Cryomold, CRYO DISH nr 3, 125 sztuk, wymiary dołka 20 x 25 x 5 (mm)	Prace Shoei	1101-3
Izopentan	Nacalai Tesque	26404-75
Naczynie do hodowli komórkowych sokoła 35 x 10mm Easy-Grip	Corning	353001
Koncentrat roztworu do pobierania antygenu, roztwór do pobierania docelowego pH 9 10x	Dako Dako	Zobacz materiał S2367	Koncentrat roztworu do pobierania antygenu w kroku 4.2.2.
Blok białkowy	Dako Dako	Zobacz materiał X0909	Roztwór blokujący, o którym mowa w 4.2.5.
Przeciwciała przeciwko fosfo-Y1798 girdynie (pY1798)	Laboratoria Immunobiologiczne (IBL) = Przedsiębiorstwo X	Numer katalogowy: 28143	Przeciwciała przeciwko fosfo-Y1798 girdynie w kroku 4.2.6.
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Naukowy	A11034
Nośniki montażowe Aquous, Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał P36930
Szkiełka nakrywkowe, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 szt. Grubość nr 1	Szkło Matsunami	C022221
Entellan Nowe, ksylenowe media montażowe do mikroskopii	Merck Millipore	107961
Szkło przesuwne z powłoką MAS białe	Szkło Matsunami	MI-MAS-01
Mapa drewniana typu KO	Prace Shoei	99-40007
Olejek immersyjny 518 F bez fluorescencji 20 ml	Zeiss	Numer katalogowy: 444960
Pipety, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)	Gilson	F144801, F123600, F123601, F123602
System produkcji wody ultraczystej	Firma Advantec	GS-590
Rękawica plastikowa, rękawica nitrylowa Star	gwiazda	Przekaźnik RSU-NGVM
Kriostat	Mikrosystemy Leica	Zobacz materiał CM1950
Zamrażarka, SANYO Ultra Low	Sanyo powiedział:	Płyta MDF-382
Lodówka gablota	Zamrażarka Nihon	NC-ME50EC
Łaźnia wodna, Thermominder SDminiN (do rozpuszczania żelatyny w temperaturze 50 C)	Taitec powiedział:	Numer katalogowy: 0068750-000
Inkubator do hybrydyzacji (do pobierania antygenu w temperaturze 50 °C)	Taitec powiedział:	Zobacz materiał HB-100
Komora inkubacyjna do barwienia immunologicznego	Cosmo Bio	10DO
Wytrząsarka odwrotna do immunohistochemii (do temperatury pokojowej)	Taitec powiedział:	NR-1
Wytrząsarka odwrotna do immunohistochemii (dla 4 C)	Tokio Rika Kikai	Złącze MMS-3010
Mikroskop stereoskopowy (do pracy z tkankami)	Olympus	SZ61
Mikroskop stereoskopowy (dla rysunku 1B)	Mikrosystemy Leica	Zobacz materiał M165FC
Mikroskop fluorescencyjny (dla rysunku 3)	Nikon	E800
Konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop	Zeiss	Zobacz materiał LSM700