Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowania
- Przygotować 10 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS): 32,27 g wodorofosforanu sodu (Na2HPO4·12H2O), 4,5 g diwodorofosforanu sodu (NaH2PO4·2H2O), 80,0 g chlorku sodu (NaCl) dodanego do wody ultraczystej do końcowej objętości 10 l. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
- Przygotować 200 ml PBS-T: 200 ml PBS z etapu 1.1 ze 100 μl eteru polioksyetylenofenylowego (10) oktylofenylowego do końcowego stężenia 0,05% (obj. obj.). Sklep w RT.
- Nosząc rękawice i ochronę oczu, przygotuj 50 ml 15% sacharozy w 10% buforowanym obojętnym roztworze formaliny: 7,5 g sacharozy dodać do 10% buforowanego obojętnego roztworu formaliny (tabela materiałów) do końcowej objętości 50 ml. Przechowywać w RT.
ostrożność: Wdychanie i/lub kontakt ze skórą/oczami z formaldehydem w 10% buforowanym neutralnym roztworze formaliny może być niebezpieczne. Obchodź się ostrożnie.
- Przygotować 1,5 ml roztworu podstawowego sprzężonego z barwnikiem falloidyną i fluorescencyjnym 200 jednostek: koniugat farby falloidynowo-fluorescencyjnej (300 jednostek w 1 fiolce, liofilizowane ciała stałe, długości fal wzbudzenia i emisji: odpowiednio 581 nm i 609 nm) zawieszone w 1,5 ml metanolu. Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 5 mg/ml roztworu podstawowego dichlorowodorku 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI): 10 mg DAPI w 2 ml N, N-dimetyloformamidu (DMF). Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.
- Przygotować 5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS: 0,5 g BSA, 10 ml PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Usuń ściętą końcówkę prostej igły o rozmiarze 18 za pomocą szczypiec i ściśnij ściśnięty koniec szczypcem w kierunku wzdłużnym, aby umożliwić przepływ cieczy przez światło igły (Rysunek 1A1).
nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
2. Sekcja zwierząt i izolacja Jejunum
- Fiksacja perfuzyjna myszy
- Noś rękawice i pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
- Przygotuj szklaną zlewkę o pojemności 100 ml, 10% buforowany neutralny roztwór formaliny, narzędzia chirurgiczne (nożyczki, kleszcze), metalową tackę, nylonowe szwy 6-0, prostą igłę 18 G przygotowaną jak w 1,7, igłę skrzydełkową 22G, strzykawkę 20 ml.
- Załadować 20 ml 10% buforowanego neutralnego roztworu formaliny ze szklanej zlewki do strzykawki o pojemności 20 ml i przymocować igłę skrzydełkową o rozmiarze 22 do wylotu.
- Przygotuj płynną żelatynę, dodając 1 g żelatyny w proszku do 20 ml PBS (końcowe 5% żelatyny) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Po namoczeniu w temperaturze pokojowej przez 15 minut, inkubować w temperaturze 50 °C w łaźni wodnej przez 15 minut bez wstrząsania.
- Krótko wirować i inkubować w temperaturze 50 °C przez kolejne 15 minut, aby całkowicie rozpuścić żelatynę. Pozostaw tubkę w pozycji RT do czasu użycia.
- Poddaj eutanazji dorosłą mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Umieść mysz z kroku 2.1.6 na metalowej tacy i wykonaj małe nacięcie na skórze przez chrząstkę za pomocą narzędzi chirurgicznych.
- Rozszerz nacięcie obiema rękami, aby odsłonić okolice klatki piersiowej i brzucha.
- Otwórz otrzewną, aby odsłonić membranę, a następnie otwórz przeponę po obu stronach.
- Przeciąć klatkę piersiową wzdłuż przednich linii pachowych po obu stronach, a następnie usunąć ścianę klatki piersiowej, przecinając w kierunku poprzecznym w miejscu grasicy, aby odsłonić serce.
- Wykonaj małe nacięcie na małżowinie usznej prawego przedsionka, aby odprowadzić krew i włóż igłę ze skrzydłami o rozmiarze 22 do wierzchołka lewej komory. Nacisnąć tłok, aby przetworzyć tkanki 10% buforowanym roztworem neutralnej formaliny.
- Po odsłonięciu narządów w miednicy odetnij koniec odbytnicy od odbytu i oddziel jelita od ciała, przecinając krezkę.
- Aby wyizolować jelito czcze, przetnij jelita na 4 cm od antrum żołądka od strony odbytu. Wyrzuć odbytową połowę pozostałego jelita cienkiego.
- Przytnij jelito czcze na pół, aby ułatwić procedurę spłukiwania. Załaduj 20 ml 10% buforowanego neutralnego roztworu formaliny do strzykawki o pojemności 20 ml i przymocuj prostą igłę o rozmiarze 18 przygotowaną w kroku 1.7 do wylotu.
- Wstrzyknąć 10% buforowany obojętny roztwór formaliny z jednego końca przyciętego jelita czczego, aby wypłukać treść jelitową i utrwalić powierzchnię światła jelita (ryc. 1A2).
- Przemyć światło jelita, wstrzykując PBS zgodnie z opisem w kroku 2.1.15.
- Przepłukać płynną żelatynę do światła jelita zgodnie z opisem w kroku 2.1.15, aby zastąpić PBS płynną żelatyną.
- Zamknij jeden koniec przyciętego jelita czczego przez podwiązanie szwem za pomocą nylonowego szwu 6-0, wypełnij jelito czcze płynną żelatyną i zamknij przeciwległy koniec przez podwiązanie szwem (ryc. 1A3).
- Dodaj cztery węzły szwów, aby dopasować przekrój jelita czczego w kształcie kiełbasy do wklęsłej części kriomoldu (ryc. 1A4).
nuta: W przypadku krioform o przekroju wklęsłym 20 mm x 25 mm x 5 mm preferowany jest przekrój jelita czczego przypominający kiełbasę ~20 mm.
- Namocz tkanki w 50 ml 15% sacharozy w 10% buforowanym roztworze neutralnej formaliny przez noc w temperaturze 4 °C.
nuta: Etapy te zapewniają krioochronę poprzez wiązanie sacharozy i białek przez formalinę żelatyny i tkanki. Żelatyna żelatyna żelatyna w formalinie nie topi się w temperaturze pokojowej, podczas gdy żelatyna żelatyniowana bez utrwalenia w temperaturze 4 °C topi się w temperaturze pokojowej.
3. Błyskawiczne zamrażanie wypełnionych żelatyną tkanek Jejunum
- Przecinając jelito czcze na węzłach szwu, uzyskuje się trzy kawałki jelita czczego przypominające kiełbasę z podwiązanymi obydwoma końcami (ryc. 1A4). Wyrównaj kawałki przypominające kiełbasę w kriomold w celu dodania związku do zatapiania w celu przygotowania zamrożonych próbek tkanek.
- Zamroź kriomold w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem. Przechowywać krioformy w temperaturze -80 °C
UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
4. Immunofluorescencja komórek kępki za pomocą swobodnie pływających kriosekcji
- Kriosekcja
- Ustaw zarówno temperaturę komory kriostatu (CT), jak i temperaturę obiektu (OT) na -22 °C. Umieść zamrożony blok tkanki w kriofordzie w komorze kriostatu na co najmniej 15 minut.
- Dodać 3 ml PBS do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego.
- Usuń zamrożony blok tkanki z kriomoldu i przetnij go na pół żyletką, aby odsłonić poprzeczny przekrój jelita czczego. Zamontuj połowę bloku na uchwycie (adapterze do kriostatu), aby przeciąć płaszczyznę cięcia za pomocą żyletki.
- Jelito czcze wypełnione żelatyną podzielić na odcinki o grubości 30 μm. Za pomocą zamrożonych kleszczy delikatnie przenieś skrawki do 35-milimetrowej płytki hodowlanej przygotowanej w kroku 4.1.2 (Rysunek 2B, po prawej).
- Zastosowanie przeciwciał pierwszorzędowych
- Umyć swobodnie pływające sekcje w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm 3 razy po 5 minut za pomocą 3 ml PBS-T, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce przeciwstawnej (około 36 razy/min).
- Przygotować roztwór do pobierania antygenu: 0,3 ml koncentratu roztworu do pobierania antygenu (tabela materiałów) w 2,7 ml ultraczystej wody. Dodać 3 ml roztworu do pobierania antygenu do 35-milimetrowej płytki hodowlanej zawierającej swobodnie pływające sekcje.
- Zamknąć pokrywę, uszczelnić szczelinę między naczyniem a pokrywką paskiem taśmy winylowej i inkubować w temperaturze 50 °C w inkubatorze do hybrydyzacji przez 3 godziny bez wstrząsania.
- Wyjąć naczynie z inkubatora i schłodzić w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po usunięciu taśmy winylowej umyj sekcje 3 razy po 5 minut każdy 3 ml PBS-T i delikatnie potrząśnij.
- Zassać PBS-T i dodać 5 kropli roztworu blokującego (Tabela materiałów) na sekcje. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, lekko wstrząsając.
- Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego: 495 μl 5% BSA w PBS z 5 μl przeciwciał fosfo-Y1798 girdyny (pY1798) (tabela materiałów). Dodać 500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na skrawki (nie trzeba usuwać roztworu blokującego).
- Umieścić naczynie w wilgotnej komorze inkubacyjnej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, lekko wstrząsając.
nuta: Nocną inkubację można przedłużyć do trzech nocy.
- Zastosowanie przeciwciał drugorzędowych
- Umyj sekcje 3 razy po 5 minut w 3 ml PBS-T delikatnie wstrząsając.
- Przygotować rozcieńczony roztwór podstawowy DAPI: 2 μl roztworu podstawowego DAPI (krok 1.5), 998 μl PBS.
- Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego: 476 μl 5% BSA w PBS, 10,5 μl rozcieńczonego roztworu DAPI, 12,5 μl sprzężonego roztworu podstawowego z barwnikiem falloidynowym i fluorescencyjnym, 1 μl koniugatu koziego barwnika anty-króliczego IgG-fluorescencyjnego (długość fali: wzbudzenie 496 nm, emisja 520 nm).
- Po zaessaniu PBS-T nanieść drugorzędowy roztwór przeciwciała i inkubować w komorze inkubacyjnej z osłoną światła w temperaturze pokojowej przez 30 minut z łagodnym wstrząsaniem.
- Umyj sekcje 3 razy po 5 minut za pomocą 3 ml PBS-T i delikatnie wstrząsając.
- Po ostatnim umyciu usuń PBS-T i zastąp go 3 ml PBS bez eteru polioksyetylenofenylowego(10) oktylofenylowego. Przenieś naczynie do mikroskopu stereoskopowego.
- Umieścić 200 μl PBS w kropli na środku szkiełka z białego szkła pokrytego MAS i przenieść jeden odcinek jelita czczego z naczynia do kropli za pomocą końcówki do pipety P200.
- Po wyregulowaniu wyrównania przekroju pod mikroskopem stereoskopowym, odessać wszystkie pozostałe PBS otaczające przekrój.
- Dodać 20 μl wodnego podłoża montażowego i umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 20 x 20 mm na wierzchu podłoża.
- Natychmiast uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego środkami montażowymi na bazie ksylenu. Umieść szkiełko na drewnianej mapie i pozwól, aby media montażowe na bazie ksylenu zastygły w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny.
nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Po zestaleniu się nośników montażowych na bazie ksylenu szkiełka można przechowywać przez 2 - 3 tygodnie w osłoniętej światłem skrzynce na suwaki w temperaturze pokojowej.
5. Mikroskopia konfokalna
- Nałóż olejek immersyjny na obiektyw 63X mikroskopu konfokalnego. Obróć szkiełko nakrywkowe w dół i umieść szkiełko na stoliku.
- Digitalizacja obrazów TC uzyskanych na długościach fal lasera 405, 488 i 555 nm i zapisywanie obrazów w formacie tiff (.tiff).
nuta: Wybierz zestaw filtrów detekcyjnych, który jest odpowiedni dla barwników fluorescencyjnych (tj. maksima wzbudzenia/emisji: 358/461 nm, 490/525 i 590/617).
