1. Hodowle komórek i pasożytów
- Hoduj komórki LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) z American Type Culture Collection (CCL-7) w kolbie do hodowli komórkowych o długości 25cm2 zawierającej w Roswell Park Memorial Institute (RPMI) pożywkę uzupełnioną 10% inaktywowaną termicznie FBS (płodową surowicę bydlęcą) i antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) w temperaturze 37 °C w 5% dwutlenku węgla (CO2).
- Zainfekuj komórki LLC-MK2 Trypanosoma cruzi (szczep Y) zgodnie z poprzednim protokołem.
- Zebrać supernatant zakażonych komórek LLC-MK2 (5 ml) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml do hodowli komórkowych i wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 22 °C w celu obniżenia resztek komórek. Utrzymywać probówkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C, aby trypomastigoty mogły dopłynąć do supernatantu.
- Zebrać supernatant do nowej stożkowej probówki i odwirować przy 2500 x g przez 15 minut w temperaturze 22 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad zawierający pasożyty w kompletnym podłożu RPMI w celu określenia gęstości komórek poprzez zliczenie komórek w komorze Neubauera.
2. Protokół kontroli immunofluorescencji
UWAGA: Po utrwaleniu, możliwe jest przechowywanie płytek zawierających szkiełka nakrywkowe w temperaturze 4 °C w 1x buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) (pH 7,2) przez jeden tydzień. Aby można je było przechowywać, ważne jest, aby komórki nie przeszły etapu przepuszczalności.
- Umieść komórki LLC-MK2 (2 x 104) w 24-dołkowych płytkach zawierających zaokrąglone szkiełka nakrywkowe sterylizowane ultrafioletem (UV) w pożywce RPMI przez 16 godzin.
- W przypadku zakażonych komórek dodać supernatant zawierający T. cruzi (pozycja 1.4) do każdej studzienki proporcjonalnie (mnogość infekcji, MOI 10:1) i pozostawić na 6 godzin infekcji. Przemyć szkiełka nakrywkowe zawierające zakażone i niezakażone komórki pięciokrotnie roztworem PBS i utrwalić 2% paraformaldehydem w 1x PBS (pH 7,2) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS (pH 7,2).
- Szkiełka nakrywkowe należy przepuszczać 0,2% IGEPAL CA-630 (oktylofenoksypolietylenetanol) w 1x PBS (PH 7,2) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
- Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym (2% albumina surowicy bydlęcej, BSA w 1x PBS, pH 7,2).
- Szkiełka nakrywkowe inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej albo z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi anty-hnRNPA1 (antyheterogenna rybonukleoproteina-A1) (rozcieńczenie 1:200) lub z mysimi poliklonalnymi przeciwciałami anty-TcFAZ (białko strefy przyczepu wici anty-Trypanosoma cruzi) (rozcieńczenie 1:100) rozcieńczonymi w roztworze blokującym.
- Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
- Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z kozim anty-mysimi IgG F (ab')2 (H + L) sprzężonymi z Alexa Fluor 488 (1:600) wraz z falloidyną skoniugowaną z Alexa 594 (1:300) w celu wybarwienia włókien aktyny (F-aktyny) w komórce gospodarza rozcieńczonej w roztworze blokującym.
- Umyj trzy razy 1x PBS (pH 7,2) przez 5 minut każdy.
- Nałóż niewielką ilość odczynnika montażowego ProLong Gold z podłożem 4',6-diamidyno-2-fenyloindolowym (DAPI) na powierzchnię szkiełka.
- Za pomocą kleszczyków delikatnie przechyl szkiełko nakrywkowe w podłożu montażowym, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Po wyschnięciu w razie potrzeby uszczelnij szkiełko nakrywkowe.
3. Podwójne znakowanie protokołu immunofluorescencji z użyciem przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych wyhodowanych na tym samym gospodarzu
- Powtórz kroki od 2.1 do 2.6 opisane powyżej.
- Inkubować szkiełka nakrywkowe zawierające zakażone i niezakażone komórki z własnym mysim przeciwciałem poliklonalnym anty-TcFAZ (1:100) rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
- Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej z kozimi anty-mysimi IgG F (ab')2 (H+L) sprzężonymi z Alexa Fluor 647 (1:600) rozcieńczonymi w roztworze blokującym.
- Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
- Drugi etap blokowania należy wykonać za pomocą AffiniPure króliczej przeciw mysim IgG (H+L) rozcieńczonej (0,12 mg/ml) w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy 1x PBS (pH 7,2) przez 5 minut każde. Następnie inkubować z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-hnRNP A1 IgG2b (1:200) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
- Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut z kozim przeciwciałem anty-mysim IgG2b sprzężonym z Alexa Fluor 488 (1:600) i z falloidyną sprzężoną z Alexa 594 (1:300) rozcieńczonym w roztworze blokującym.
- Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy po 5 minut za pomocą 1x PBS.
- Powtórz kroki od 2.8 do 2.10 opisane powyżej.
