Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych

Streszczenie

Źródło: Elgundi, Z., et al. Produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje technikę oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z supernatantu hodowli uzyskanego z hodowli komórkowej wytwarzającej przeciwciała. Proces ten polega na wykorzystaniu matrycy usieciowanych kulek agarozy ze sprzężonym białkiem A, które unieruchamia przeciwciała w supernatancie na kulkach, co pozwala na skuteczne oddzielenie od zanieczyszczeń. Poprzez zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH oddziaływanie białka A z przeciwciałem zostaje rozluźnione, co ułatwia zbieranie frakcji zawierających przeciwciała.

Protokół

1. Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa przy użyciu zautomatyzowanego systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)

UWAGA: Poniższa procedura może być ogólnie stosowana do większości zautomatyzowanych systemów. Oczyszczanie można przeprowadzić w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C (jeśli system FPLC jest przechowywany w chłodnym pomieszczeniu). Można przeprowadzić serię testów zwiadowczych w celu określenia optymalnych warunków oczyszczania, w tym odpowiedniej matrycy kolumny, buforu wiążącego, buforu elucyjnego i pH, aby zapewnić maksymalny odzysk oczyszczonego przeciwciała z kondycjonowanych pożywek (patrz sekcja Wyniki). Optymalne warunki zależą od oczyszczanego przeciwciała lub białka. Oczyszczanie przeprowadzono na zautomatyzowanym systemie FPLC. Oczyszczanie przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy użyciu 5 ml kolumny białka A.

1. Przygotuj następujące przy użyciu ultraczystej wody i dostosuj do zalecanego pH, a następnie przefiltruj przez filtr 0,22 μm.
   1. Przygotować 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4 (bufor wiążący), mieszając następujące elementy: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na₂HPO₄ i 0,001 M KH₂PO₄. W razie potrzeby dostosować pH przed filtrowaniem buforu.
   2. Przygotować 500 ml 0,1 M glicyny-HCl o pH 2,7 (bufor elucyjny). Dostosuj pH przed przefiltrowaniem buforu.
   3. Przygotować 50 ml 1 M Tris pH 9,0 (bufor neutralizacyjny).
2. Upewnij się, że wszystkie połączenia zasilania systemu i komunikacji z komputerem są wykonane. Urządzenia powinny być widoczne w module oprogramowania "Kontrola systemu". Upewnij się, że ogniwo UV jest ustawione na długość fali 280 nm. Opcjonalnie: Skalibruj pH-metr, jeśli jest podłączony i ma być używany.
3. Zanurz rurki wlotowe A, B i pompę próbki w ultraczystej wodzie, aby umyć system. Przedmuchnąć pompy strzykawką, jeśli w przewodzie znajduje się powietrze lub istnieje podejrzenie, że w układzie znajduje się powietrze. Umyj system wodą ręcznie za pomocą sterownika systemu lub metodą automatyczną. Należy zwrócić uwagę, że ciśnienie, przewodność, śledzenie UV280 i pH pozostają stałe oraz że limit ciśnienia w kolumnie nie jest przekroczony zgodnie ze specyfikacją producenta.
   nuta: Nieprawidłowości mogą wskazywać na powietrze lub zablokowanie systemu, które należy usunąć przed kontynuowaniem.
4. W module sterownika systemu uruchomić natężenie przepływu na poziomie 1 ml/min ręcznie za pomocą pompy A w pozycji obciążenia (z pominięciem pętli próbki) lub wtrysku (przez pętlę próbki), aby rozpocząć podłączanie kolumny. Odłącz rurkę systemową na wlocie kolumny w pozycji kolumny i usuń korek podłączony do wlotu kolumny.
   1. Pozwól, aby woda spływała z rurki systemu kroplami na górze kolumny, a następnie przymocuj rurkę systemu do kolumny. Przelewanie się wlotu kolumny i armatury wlotowej z kroplami wody zapewnia połączenie wolne od pęcherzyków powietrza.
5. Przymocuj wylot kolumny do wylotu za kolumną i sprawdź, czy wszystkie złączki są dobrze dokręcone. Gdy kolumna jest teraz podłączona do systemu, nie należy przekraczać limitów maksymalnego limitu ciśnienia i natężenia przepływu, jak opisano w specyfikacji kolumny.
6. Przemyć kolumnę 5 objętościami kolumny (CV) wody. W razie potrzeby kontynuuj mycie kolumny, aż śledzenie UV280 się ustabilizuje.
7. Zanurzyć rurki wlotowe A w buforze wiążącym, B w buforze elucyjnym, a pompę próbki w buforze wiążącym, aby zrównoważyć system w odpowiednich. Napełnij rurki wlotowe buforem za pomocą PumpWash ręcznie.
8. W module "Edytor metod" oprogramowania użyj kreatora metody, aby skonfigurować metodę chromatografii powinowactwa dla kolumny, która ma być używana.
   nuta: Zautomatyzowane systemy FPLC są wyposażone w metody wstępnie napełnione zalecanymi ustawieniami (tj. natężeniem przepływu i limitem ciśnienia) i uruchamiają kroki w oparciu o kolumnę (producenta, matrycę i rozmiar) wybraną do oczyszczania.
   1. Wykonaj następujące kroki uruchamiania dla chromatografii powinowactwa białka A:
      1. System równowagi z buforem wiążącym o mocy 5 CV i przepływem zbiorczym do pojemnika na odpady.
      2. Załadować próbkę do kolumny (objętość do załadowania jest określana ręcznie w metodzie) i zebrać przepływ do oddzielnego pojemnika.
      3. Przemyć system z 5 CV buforu wiążącego i zebrać przepływ do oddzielnego pojemnika.
      4. Kolumnę elutyczną z frakcjonowaniem izokratycznym 5 CV za pomocą buforu elucyjnego i zebrać oczyszczoną próbkę przeciwciał jako frakcje przez kolektor frakcji.
      5. System równowagi z buforem wiążącym o mocy 5 CV i przepływem zbiorczym do pojemnika na odpady.
9. Po skonfigurowaniu metody określ objętość kondycjonowanego nośnika, który ma zostać zastosowany do kolumny, i zapisz metodę.
   nuta: Objętość określona w metodzie powinna być o 5-10 ml mniejsza niż rzeczywista objętość, aby uniknąć wprowadzenia powietrza podczas pobierania próbki. Określona objętość używana w tym protokole to 90-120 ml.
10. Zanurzyć rurkę pompy do pobierania próbek w naczyniu zawierającym kondycjonowane media.
11. Przygotować oddzielny pojemnik do pobierania próbki przepływającej przez określony przewód wylotowy.
    nuta: Ważne jest, aby zebrać przepływ w przypadku wystąpienia błędu podczas przebiegu lub przekroczenia zdolności wiązania kolumny, co wymaga ponownego nałożenia przepływu na kolumnę lub powtórzenia oczyszczania.
12. Przygotować probówki zbiorcze w kolektorze frakcji. Dodać 100 μl buforu neutralizacyjnego na 1 ml objętości frakcji. System FPLC automatycznie eluuje frakcje do probówek zbiorczych.
13. W module "Kontrola systemu" oprogramowania otwórz metodę, która ma zostać uruchomiona.
    nuta: Uruchomienie metody jest inicjowane w serii stron, które obejmują sprawdzanie zmiennych metody, konfigurację kolektora frakcji oraz definiowanie nazwy pliku wynikowego i miejsca przechowywania.
14. Kliknij przycisk START, aby zainicjować uruchomienie. Przebieg można monitorować w module "Sterowanie systemem".
15. Po zakończeniu procesu oczyszczania sprawdzić wynikowy chromatogram w module "Ocena" w oprogramowaniu systemowym.
16. Połączyć wszystkie frakcje zawierające białko w oddzielnej probówce, wymienić bufor i zagęścić w PBS za pomocą filtra odśrodkowego z odciętą masą cząsteczkową 30 kDa. Wykonać etapy wirowania zgodnie z instrukcjami producenta.
17. Zmierz stężenie przeciwciał za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta.
18. Jeśli ma być przeprowadzony kolejny cykl oczyszczania, zalać rurkę pompy próbki w buforze wiążącym i powtórzyć kroki 1.9-1.14.
19. Po zakończeniu procesów oczyszczania zanurzyć rurki wlotowe A, B i pompę do pobierania próbek w wodzie ultraczystej i umyć układ i kolumnę, jak wykonano w kroku 3.
20. Zanurz rurki A, B i rurki pompy do pobierania próbek w 20% etanolu i powtórz procedurę mycia w celu przechowywania układu i kolumny.
21. Odłącz kolumnę od dolnego wylotu i załóż korek kolumny, a następnie odłącz kolumnę na wlocie i wymień korek, ponownie podłącz rurkę do systemu. Przechowywać kolumnę w temperaturze 4 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tabletki z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,4, 100 ml	09-2051-100	Astralny Naukowy
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml kolumna	Galaktyka GE17-0403-01	Sigma-Aldrich
AKTApurifier 100	28406266	GE Opieka zdrowotna	Zautomatyzowany system FPLC, który może zawierać pompę do próbek P-960 i kolektor frakcji Frac-920.
Glicyna-HCl	G2879	Sigma-Aldrich
Kwas cytrynowy, monohydrat	BIOC2123	Astralny Naukowy
Cytrynian sodu, sól trisodowa dwuwodna	BIOCB0035	Astralny Naukowy
1 M roztwór Tris-HCl o pH 9,0	BIOSD8146	Astralny Naukowy
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra (30 MWCO)	UFC803008/UFC903008	Merck Millipore	Służy do buforowania, wymiany i koncentratu oczyszczonego białka.
Zestaw do oznaczania kwasu bicynchoninowego pierce'a (BCA)	Numer katalogowy: 23227	Thermo Fisher Naukowy
System BLItz	45-5000	fortéBIO	Przyrząd służący do pomiarów interferometrii biowarstwowej (BLI).
Biosensory białka A	Numer katalogowy: 18-5010	fortéBIO