Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie tkanek
- Przygotować 4% formaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4 w dniu poprzedzającym perfuzję. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Głęboko znieczulone myszy (3,5% izofluranu) przetrzeć przezskórnie przez lewą komorę 10 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie 40 ml lodowatego formaldehydu (szybkość przepływu 5 ml / min). Wypreparować mózg i umieścić go w tym samym utrwalaczu przez 24 godziny w temperaturze 4°C.
- Przenieś kolejno mózg do 10% (24 godziny w 4°C) i 30% sacharozy (aż do zatonięcia mózgu, ok. 48 godzin). W celu zamrożenia powoli zanurz kriochronione mózgi w izopentanie o temperaturze -25 °C, aż z tkanki nie wydobędą się pęcherzyki. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Wyciąć przekroje koronalne o grubości 40 μm na mikrotomie zamrażającym (temperatura bloku od -25 do -16 °C). Sekwencyjnie przenieść skrawki do roztworu niezamarzającego zawierającego studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (patrz rysunek 1). Przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Barwienie immunologiczne
UWAGA: Sekcje są przetwarzane swobodnie pływające, zwykle w płytkach 6-dołkowych wyposażonych w płytkę nośną i wkładki siatkowe. W drodze wyjątku blokowanie, inkubacja przeciwciał i reakcje kompleksu awidyna-biotyna (ABC) przeprowadza się na płytkach 12- lub 24-dołkowych bez wkładek siatkowych (wystarczy 0,5 do 1 ml na studzienkę, w zależności od liczby plastrów, które należy wybarwić). Podczas tych kroków przenieś sekcje za pomocą cienkiej szczoteczki (spłucz każdym nowym roztworem). Wszystkie inkubacje odbywają się przy ciągłym mieszaniu (maks. 150 obr./min).
- Immunohistochemia (metoda ABC)
- Przenieść skrawki płynu niezamarzającego do soli fizjologicznej buforowanej trójdzielnie (TBS) i dokładnie spłukać (raz O/N w temperaturze 4 °C, 5 razy w temperaturze pokojowej [RT] przez 10 minut każda), aby całkowicie usunąć płyn niezamarzający.
- Aby wygasić endogenną aktywność peroksydazy, inkubować przez 30 minut w 1,5% H2O2 w TBS-Tween 20 (TBS-T). Zwróć uwagę na bulgotanie i w razie potrzeby ponownie zanurz sekcje. Płucz 3 razy w TBS po 15 minut.
- Opcjonalnie: W międzyczasie podgrzej komorę grzewczą i 2 N HCl do 37 °C. W celu denaturacji DNA należy inkubować skrawki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 2 N HCl. Delikatnie rozdzielić sekcje za pomocą pędzla.
- Opcjonalnie: Neutralizacja sekcji przez 10 minut w 0,1 M buforze boranowym pH 8,5, RT. Podczas przenoszenia krótko przetrzyj wkładki siatkowe zawierające sekcje na ręczniku papierowym, aby usunąć resztki HCl. Płukać 2 razy w TBS przez 15 minut każdy.
- Inkubować w TBSplus w celu przepuszczalności tkanki i zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Inkubować w przeciwciałie pierwszorzędowym rozcieńczonym w TBSplus, O/N w temperaturze 4 °C. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każdy.
- Inkubować w biotynylowanym przeciwciałie drugorzędowym rozcieńczonym w TBSplus przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każdy. Tymczasem...
- Przygotuj kompleks ABC zgodnie z protokołem producenta (1% A + 1% B w TBS-T). Odstawić na 30 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem. Inkubować skrawki w odczynniku AB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każda.
- Przygotować 50 ml 0,5 mg/ml 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) w TBS-T na płytkę 6- lub 12-dołkową, podzielić na dwie połówki i pipetować odpowiednio 4 ml lub 2 ml na dołek. Przenieś sekcje do roztworu DAB (UWAGA! DAB jest toksyczny. Postępuj zgodnie z konkretnymi kartami charakterystyki dostarczonymi przez dostawcę, tj. noś fartuch laboratoryjny i rękawice oraz używaj okapu na opary chemiczne).
- Dodać 0,5 ml 1% H2O2 do pozostałych 25 ml roztworu DAB, wymieszać i odpipetować równoważne objętości jak powyżej do każdego dołka, aby rozpocząć reakcję peroksydazy. Inkubować przez 12 minut. Płucz 3 razy w TBS po 15 minut.
- Zamontuj sekcje do szkiełek w żelatynie i suchym powietrzu O/N. Szkiełko nakrywkowe ze stałym medium montażowym.
- Opcjonalnie: Przeciwbarwić przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego.
nuta: Jeżeli stosunek sygnału do szumu jest niski z powodu wysokiego tła, należy powtórzyć zabiegH2O2po inkubacji z odczynnikiem AB (etap 2.1.8).
- Wielokrotna immunofluorescencja
- Pojedyncza lub jednoczesna immunofluorescencja mnoga
- Przenieść skrawki płynu niezamarzającego do TBS i dokładnie spłukać (raz O/N w temperaturze 4 °C, 5 razy w temperaturze pokojowej przez 10 minut każde), aby całkowicie usunąć płyn niezamarzający.
- Opcjonalnie: jak w krokach 2.1.3 - 2.1.4.
- Inkubować w TBSplus w celu przepuszczalności tkanki i zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał, 1 godzina w RT.
- Inkubować w pierwotnym koktajlu przeciwciał (np. szczurzego α-BrdU (bromodeoksyurydyna), świnka morska α-DCX (podwójna kortyna), koza α-GFP (białko zielonej fluorescencji)) rozcieńczonej w TBSplus, O/N w temperaturze 4°C. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każdy.
- Inkubować w koktajlu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluorochromem (np. Rhodamine Red α-szczur, Alexa-647 α-świnka morska, Alexa-488 α-koza; wszystkie pochodzące od osła) rozcieńczonych w TBSplus, 3 godziny w temperaturze RT lub O/N w temperaturze 4 °C. Od teraz chroń sekcje przed światłem. Płucz 3 razy w TBS po 15 minut.
- Zamontuj sekcje do szkiełek w żelatynie i wysusz na powietrzu przez noc (O/N). Szkiełko nakrywkowe z wodnym medium montażowym.
- Sekwencyjna immunofluorescencja mnoga z pierwszorzędowymi przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza
- Jako kroki 2.2.1.1 - 2.2.1.3.
- Inkubować w pierwszym przeciwciałie pierwszorzędowym (np. króliczym antygenie α A), O/N w temperaturze 4 °C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każdy.
- Inkubować w pierwszym przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluorochromem (np. Rhodamine Red-conj. osioł α-królik), 3 godziny RT. Od teraz chroń sekcje przed światłem. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każde.
- Inkubować w 10% normalnej surowicy od tego samego gospodarza, co przeciwciała pierwszorzędowe (np. surowica królicza) przez 3 godziny RT, aby nasycić otwarte paratopy na pierwszym przeciwciałie drugorzędowym. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każde.
- Inkubować w TBSplus z 50 μg/ml niesprzężonych monowalentnych fragmentów Fab skierowanych przeciwko gospodarzowi przeciwciał pierwszorzędowych (np. IgG α-królika (H+L)) w celu pokrycia epitopów, które można rozpoznać przez drugie przeciwciało drugorzędowe, O/N w temperaturze 4 °C.
- Płukać co najmniej 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każdy. Podczas przenoszenia pokrótce przetrzyj wkładki siatkowe zawierające sekcje na ręczniku papierowym, aby usunąć wszelkie resztki Fab.
- Inkubować w drugim przeciwciałie pierwszorzędowym (np. króliczym antygenie α B), O/N w temperaturze 4 °C. Płukać 3 razy w TBS i raz w TBS-T przez 10 minut każdy.
- Inkubować w drugim przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z fluorochromem (np. Alexa-488-conj. osioł α-królik), 3 godziny RT. Płukać 3 razy w TBS przez 15 minut każdy, zamontować i nakryć szkiełko jak wyżej.
nuta: Aby oznaczyć antygeny przeciwciałami od różnych gatunków gospodarzy, dodaj je do kroku 2.2.2.2, a odpowiednie przeciwciała drugorzędowe do kroku 2.2.2.3.
