$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie zwierząt
- Znieczulij myszy za pomocą 3% izofluranu. Otwórz klatkę piersiową, wykonując poziome nacięcie w okolicy nad środkową częścią brzucha i ciągnąc za skórę. Ostrożnie wykonaj kolejne nacięcie, aby otworzyć jamę klatki piersiowej bez nakłuwania innych narządów.
- Wykonaj perfuzję serca najpierw przez wierzchołek, a następnie przez prawą komorę, używając zimnego 3% aldehydu glutarowego w roztworze kardioplegicznym (50 mM KCl, 5% dekstrozy w PBS, patrz Tabela 1) przez 2 minuty, aby zapewnić całkowite rozluźnienie mięśnia sercowego.
- Perfuzję serca za pomocą lodowatego 3% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforu kakodylanu sodu (pH 7,4) przez kolejne 2 minuty. Używając ciśnienia grawitacyjnego, użyj igły 25 G 5/8", aby wprowadzić utrwalacze do serca. Natychmiast po tym, jak serce zacznie wypełniać się utrwalaczem, podnieś wierzchołek serca i przetnij naczynia pod spodem w odległości 1-2 mm od serca, aby zmniejszyć ciśnienie i umożliwić odpływ płynów.
- Wypreparuj serce, usuń przedsionki i zanurz komory w lodowatym 3% aldehydzie glutarowym/0,1 M kakodylanu sodu na szalce Petriego. Wykonaj cięcie motyla po 30-60 minutach utrwalania i umieść go na szalce Petriego zawierającej 3% aldehydu glutarowego/kakodylanu (patrz tabela materiałów). Posiekaj serce za pomocą ostrza chirurgicznego w małe kostki o wielkości 1 mm3 w roztworze aldehydu glutarowego/kakodylanu.
- Utrwalić/zanurzyć wypreparowaną tkankę serca w roztworze aldehydu glutarowego/kakodylanu na 24 godziny w temperaturze 4 °C.
2. Przetwarzanie tkanki serca
- Po 24 godzinach utrwalania przemyć tkanki w 0,1 M buforu kakodylanu sodu przez 20 minut.
- Przygotować 0,1 M bufor kakodylowy, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
- Aby przygotować 0,1 M bufor kakodylanu sodu, należy przygotować zapas 1 M buforu kakodylanu sodu, rozpuszczając kakodylan sodu (21,4 g) i 1% roztwór chlorku wapnia (3 ml) w 90 ml wody destylowanej. Zwiększ objętość roztworu do 100 ml, dodając wodę destylowaną. Dobrze wymieszaj roztwór i pozostaw na noc, aby rozpuścił substancję rozpuszczoną.
- Następnie weź 10 ml 1 M roztworu podstawowego kakodylanu sodu i dodaj go do 80 ml wody destylowanej. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl i zwiększ objętość do 100 ml, dodając wodę destylowaną.
- Powtórzyć płukanie w 0,1 M buforze kakodylanu sodu przez kolejne 20 minut. Usunąć tkanki z buforu kakodylanu sodu i zanurzyć je w 2% roztworze tetratlenku osmu na 4 godziny w temperaturze pokojowej. Ten proces nazywa się osmikacją.
- Przygotuj 2% roztwór tetratlenku osmu, wykonując poniższe czynności.
- Aby przygotować 2% roztwór tetratlenku osmu, weź 4% roztwór tetratlenku osmu, 4 ml (patrz tabela materiałów), 1 M roztwór podstawowy kakodylanu sodu (0,8 ml) i wodę destylowaną (3,2 ml), aby uzyskać łącznie 8 ml roztworu.
nuta: Cały ten proces i kolejne kroki należy przeprowadzić w dygestorium.
- Po osmikacji zanurz tkanki w 2% roztworze octanu sodu na 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 2% roztwór octanu sodu, rozpuszczając 4 g octanu sodu w 20 ml wody destylowanej.
- Następnie zanurz tkanki w 2% roztworze octanu uranylu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 2% roztwór octanu uranylu, rozpuszczając 4 g octanu uranylu w 20 ml wody destylowanej.
- Po barwieniu octanem uranylu należy odwodnić tkanki kolejno za pomocą stopniowanych alkoholi i acetonu w kolejności podanej w tabeli 2.
3. Osadzanie tkanki serca
- Osadź odwodnione tkanki w żywicy epoksydowej o niskiej lepkości, wykonując poniższe czynności.
- Aby wytworzyć żywicę epoksydową o niskiej lepkości, wymieszaj 10,24 ml monomeru epoksydowego dwutlenku cykloheksenu winylu, 6,74 ml eteru diglicydylowego glikolu polipropylenowego (DER 732) i 30,05 ml bezwodnika nonenylobursztynowego (NSA) (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 50 ml. Dobrze mieszać zawiesinę ręcznie przez 2 minuty.
- Dodać 18 kropli przyspieszacza epoksydowego 2-dimetyloaminoetanolu (DMAE, patrz tabela materiałów) i wymieszać zawiesinę, aby dokładnie wymieszać składniki.
- Zaimpregnować tkanki żywicą epoksydową w następującej kolejności mieszanki.
- Zastąp 100% aceton żywicą 1:1: zawiesina acetonu i zanurz w niej tkanki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Zastąp żywicę: zawiesinę acetonu żywicą 6:1: zawiesinę acetonu i zanurz w niej tkanki na 3 godziny.
- Na koniec zastąp zawiesinę żywicy 6:1 – acetonem 100% zawiesiną żywicy i pozostaw zanurzone w niej tkanki na noc w temperaturze pokojowej.
- Umieść chusteczki w świeżej żywicy w mikroforemkach o średnicy 8 mm (patrz tabela materiałów) i utwardź osadzone tkanki w temperaturze 70 °C przez noc.
nuta: Upewnij się, że żywica jest twarda, ale nie krucha po utwardzeniu.
4. Cięcie tkanek za pomocą ultramikrotomu
- Przyciąć bloki żywicy z tkanką do nie większej niż 1 mm przed zamontowaniem na ultramikrotomie (patrz Tabela materiałów). Umieść formę tak precyzyjnie, jak to możliwe, w segmentowym ramieniu ultramikrotomu i ręcznie przesuń formę próbki w kierunku noża diamentowego.
- Wytnij sekcje o grubości 500 nm (pół mikrona) nożem Histo (patrz Tabela materiałów) i za pomocą narzędzia do pętli EM podnieś je i umieść na szkiełku podstawowym.
- Umieść szklane szkiełko na płycie grzejnej, aby uzyskać niebieską plamę toluidynową, aby znaleźć obszar zainteresowania.
- Po znalezieniu obszaru zainteresowania użyj noża Ultra 45° (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać ultracienkie sekcje z jasnego złota (100 nm). Umieść te ultracienkie sekcje po matowej stronie miedzianej siatki o oczkach 200.
5. Ultracienkie barwienie sekcji serca
- Barwienie należy rozpocząć od zdemaskowania antygenu za pomocą roztworu do wytrawiania, tj. 5% roztworu metaperiodianu sodu.
- Przygotować 500 μl 5% roztworu metaperiodianu sodu (patrz Tabela Materiałów) w wodzie destylowanej.
nuta: Przygotuj świeży roztwór przed użyciem.
- Umieść 20 μl roztworu metaperiodynianu sodu na czystej folii parafinowej. Umieść całkowicie wysuszone siatki z sekcjami tkanek na kropli roztworu do wytrawiania.
nuta: Matowa strona siatki z sekcją tkankową musi być skierowana w stronę roztworu do trawienia.
- Pozostaw siatkę sekcji na roztworze na 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj wytrawiony fragment tkanki, umieszczając go na kropli wody destylowanej na 60 s.
- Zablokuj resztkowe aldehydy, umieszczając siatki sekcyjne na kropli 0,05 M roztworu glicyny na 10 minut w temperaturze pokojowej. Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej, aby usunąć resztki roztworu glicyny.
- Przygotować 0,05 M roztwór glicyny (patrz Tabela Materiałów) rozpuszczając 3,75 mg glicyny w 1 ml 1x PBS (pH 7,4).
- Umieścić kratki sekcyjne w 10-20 μl roztworu blokującego na 25 minut w temperaturze pokojowej.
nuta: Skład roztworu blokującego: 2 μL 1% normalnej surowicy koziej (NGS) + 20 μL 1% BSA (stężenie końcowe: 10%) + 178 μL 1x PBS (pH 7,4), aby uzyskać końcową objętość 200 μL.
- Osusz krawędzie siatki na bibule filtracyjnej i umieść część siatki na rozcieńczalniku przeciwciał w celu kondycjonowania w temperaturze pokojowej na 10 minut.
- Inkubować skrawki siatki z pierwszorzędowym przeciwciałem (w tym przypadku Sigmar1, patrz Tabela Materiałów; rozcieńczone w stosunku 1:10 w rozcieńczalniku przeciwciał) przez 1 godzinę 30 minut w wilgotnej komorze.
- Osuszyć siatkę i umyć sekcje siatki rozcieńczalnikiem przeciwciał dwa razy przez 5 minut każdy.
- Inkubować skrawki siatki z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym (w tym przypadku biotynylowanym kozim poliklonalnym przeciwciałem poliklonalnym przeciwko królikowi, patrz Tabela materiałów; rozcieńczone w stosunku 1:10 w rozcieńczalniku przeciwciała) przez 1 godzinę w wilgotnej komorze.
- Osuszyć siatkę i umyć sekcje siatki rozcieńczalnikiem przeciwciał dwa razy przez 5 minut każdy.
- Inkubować odcinki siatki w dostępnej w handlu QD sprzężonej ze streptawidyną (QD655nm, patrz Tabela materiałów; rozcieńczony w stosunku 1:10 w rozcieńczalniku przeciwciała) przez 1 godzinę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Zapobiegaj ekspozycji na światło, przykrywając komorę folią aluminiową.
- Osusz krawędzie rusztu za pomocą bibuły filtracyjnej i umyj sekcje siatki, umieszczając je na kropelkach wody na 2 minuty.
- Osusz krawędzie siatki do wyschnięcia.
Tabela 1: Skład PBS i innych roztworów stosowanych do odwadniania tkanek.
| bufor | kompozycja | ilość |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (1x) (1 L) | chlorek sodu | 8 gramów |
| Chlorek potasu | 0,2 grama |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | 1,44 grama |
| Fosforan potasu jednozasadowy | 0,24 grama |
| Dostosuj pH do 7,4 | |
Tabela 2: Zastosowanie stopniowanego alkoholu i acetonu do dehydratacji tkanek (Krok 2.5)
| składnik | Godzina |
| 50% etanolu | Czas trwania: 10 min |
| 70% etanolu | Czas trwania: 10 min |
| 95% etanolu | Czas trwania: 10 min |
| 100% etanol | Czas trwania: 20 min |
| 100% etanol | Czas trwania: 20 min |
| 100% aceton | Czas trwania: 30 min |
| 100% aceton | Czas trwania: 30 min |