$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie zwierząt i fiksacja nerek
- Wykonaj utrwalenie perfuzji, wykonując poniższe czynności.
- Znieczulić mysz poprzez inhalację izofluranu (3%, 2,0 l/min) i dootrzewnowe podanie chlorowodorku medetomidyny (0,3 mg/kg), winianu butorfanolu (5 mg/kg) i midazolamu (4 mg/kg) (patrz tabela materiałów).
- Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia z 20 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) i 30 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w buforze fosforanowym (PB) przez lewą komorę serca.
- Wykonaj fiksację zanurzeniową zaraz po fiksacji perfuzyjnej i pobraniu próbki nerki.
- Zanurz nerkę w 4% PFA w temperaturze 4 °C na dodatkowe 16 godzin, a następnie przepłucz ją PBS przez 2 godziny (trzy razy)9 (Rysunek 1).
ostrożność: Formaldehyd i paraformaldehyd są toksycznymi substancjami drażniącymi. Z odczynnikami należy obchodzić się pod wyciągiem z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
2. Odbarwianie i delipidacja
- Przygotuj CUBIC-L (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) do odbarwiania i delipidacji składającej się z 10% wagowych Triton X-100 i 10% wagowych N-butylodietanoloaminy (patrz tabela materiałów), zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami.
- Wykonaj odbarwianie i delipidację za pomocą CUBIC-L, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
- Zanurzyć utrwaloną nerkę w 7 ml 50% (v/v) CUBIC-L (mieszanina wody i CUBIC-L 1:1) w okrągłej probówce o pojemności 14 ml (patrz Tabela materiałów) delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 6 godzin (Rysunek 2A). Następnie zanurzyć go w 7 ml CUBIC-L w 14 ml probówce z okrągłym dnem, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C przez 5 dni.
- Podczas tego procesu codziennie odświeżaj CUBIC-L. Po procesie odbarwiania i delipidacji płucz nerkę PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny (trzy razy) (ryc. 1). Użyj łyżki dozującej do obsługi próbki (Rysunek 2B).
3. Barwienie immunofluorescencyjne w całości
- Przygotuj do barwienia.
- Przygotować bufor barwiący dla przeciwciał pierwszorzędowych, mieszając 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% kazeiny z PBS i 0,05% azydku sodu.
- Przygotować bufor barwiący dla przeciwciał drugorzędowych, mieszając 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% kazeiny z PBS i 0,05% azydku sodu.
- Wykonaj barwienie przeciwciałami pierwszorzędowymi.
- Wybarwić immunologicznie zdelipidowaną nerkę przeciwciałami pierwszorzędowymi (1:100 lub 1:200, patrz tabela materiałów) w buforze barwiącym w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając przez 7 dni.
nuta: Ilość buforu barwiącego potrzebna na jedną nerkę wynosi 500-600 μL (ryc. 2C).
- Płucz nerkę 0,5% (v/v) Triton X-100 w PBS (PBST) w temperaturze pokojowej przez 1 dzień (Rysunek 1).
- Wykonaj barwienie przeciwciałami wtórnymi.
- Wybarwić immunologicznie nerkę przeciwciałami drugorzędowymi (1:100 lub 1:200, patrz tabela materiałów) w buforze barwiącym w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając przez 7 dni. Płucz nerkę PBST w temperaturze pokojowej przez 1 dzień (ryc. 1).
- Po utrwaleniu zanurzyć nerkę w 1% formaldehydzie w PB (mieszanina 37% formaldehydu i PB w stosunku 1:36) na 3 godziny i przemyć PBS w temperaturze pokojowej przez 6 godzin (ryc. 1).
4. Dopasowanie współczynnika załamania światła (RI)
- Przygotuj CUBIC-R+.
- Przygotować CUBIC-R, mieszając 45% wag. 2,3-dimetylo-1-fenylo-5-pirazolonu/antypiryny i 30% wag. nikotynamidu (patrz tabela materiałów).
- Przygotuj CUBIC-R+ do dopasowania współczynnika załamania światła (RI), dodając 0,5% v% N-butylodietanoloaminy do CUBIC-R zgodnie z poprzednio opublikowanymi raportami.
- Wykonaj dopasowywanie wystąpień zarezerwowanych.
- Zanurz nerkę w 7 ml 50% (v/v) CUBIC-R+ (mieszanina wody i CUBIC-R+ w stosunku 1:1) w probówce o okrągłym dnie o pojemności 14 ml, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 1 dzień. Następnie zanurz go w 7 ml CUBIC-R+ w probówce z okrągłym dnem o pojemności 14 ml, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 2 dni (Rysunek 1).
nuta: Chociaż nerka unosi się w 50% CUBIC-R + na początku dopasowania RI, opada i staje się przezroczysta w CUBIC-R + pod koniec procesu (Figura 2D).
5. Akwizycja i rekonstrukcja obrazu
- Zanurz nerkę dopasowaną do RI w mieszaninie oleju silikonowego (RI = 1,555) i oleju mineralnego (RI = 1,467) (55:45) podczas akwizycji obrazu (RI = 1,51) (ryc. 3).
- Uzyskaj obrazy 3D całej nerki za pomocą specjalnie zbudowanego mikroskopu fluorescencyjnego z arkuszami świetlnymi (patrz tabela materiałów). Zbierz wszystkie nieprzetworzone dane obrazu w 16-bitowym formacie TIFF. Wizualizuj i przechwytuj obrazy renderowane w 3D za pomocą oprogramowania do analizy obrazowania (Imaris, patrz tabela materiałów).
