Wszystkie procedury związane z pobraniem próbki zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB,
1. Kolekcja biopsji skóry
- Pozwól wykwalifikowanemu lekarzowi wykonać biopsję skóry w odpowiednich warunkach klinicznych.
- Wybierz obszar, w którym chcesz wykonać biopsję skóry i oczyść go wacikiem nasączonym alkoholem.
- Przygotuj roztwór znieczulający z 1 ml lidokainy 2%.
- Trzymając igłę równolegle do obszaru, wstrzyknąć znieczulenie miejscowe podskórnie.
- Po sprawdzeniu efektu znieczulenia weź jednorazowy dziurkacz o średnicy 3 mm i delikatnie dociśnij rotacyjny i delikatny nacisk w dół, aby obrócić go w dół przez naskórek i skórę właściwą, aż do osiągnięcia podskórnej tkanki tłuszczowej.
- Wycofaj stempel.
- Użyj jednorazowych kleszczy, aby delikatnie pociągnąć zatyczkę do skóry.
- Za pomocą nożyczek wyciąć podstawę próbki na poziomie tkanki tłuszczowej.
- Umieścić próbkę w probówce zawierającej 10 ml roztworu utrwalającego lizynę i paraformaldehyd (PLP).
- Zdezynfekuj obszar i przykryj go bandażem samoprzylepnym.
2. Utrwalanie i przechowywanie tkanek
- Przygotować świeży roztwór utrwalający PLP (patrz Tabela 1).
- Natychmiast po pobraniu biopsji skóry zanurzyć ją w probówce zawierającej 10 ml roztworu utrwalającego PLP i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 4 °C.
- Następnego dnia, pod wyciągiem, delikatnie usunąć utrwalacz PLP i w tej samej probówce przemyć biopsję 3 razy przez 5 minut 5 ml 0,1 M roztworu Sorensena (Tabela 1).
- Odrzucić roztwór Sorensena i inkubować biopsję z 5 ml roztworu krioprotekcji O/N w temperaturze 4 °C.
- Przechowywać biopsję w temperaturze 4 °C, jeśli cięcie kriotomem jest wykonywane w ciągu 1 tygodnia; przechowywać biopsję w temperaturze -20 °C, jeśli cięcie jest wykonywane w ciągu 3 miesięcy; umieścić biopsję w kriofordzie (kroki 3.2-3.4) i przechowywać ją w temperaturze -80 °C, aby zachować ją przez dłuższy czas.
3. Cięcie tkanek za pomocą kriotomii
- Ustawić kriotom na -20 °C.
- Weź kriomold i napełnij go podłożem do zatapiania w krio. Unikaj tworzenia bąbelków.
- Za pomocą pęsety zanurz biopsję w podłożu do zatapiania w krioterapii z osią podłużną (naskórek - skóra właściwa) równoległą do dna krioformy.
- Zatrzaskowo zamroź próbkę ciekłym azotem, aby uzyskać stałą kostkę pożywki do zatapiania w krio, zawierającą biopsję we właściwej orientacji.
- Umieść próbkę w kriostacie i odczekaj 30 minut, aby biopsja mogła się zaaklimatyzować.
- Umieścić próbkę na kriostacie i wyciąć odcinki o grubości 50 μm.
- Za pomocą małego pędzelka przenieś kriosekcje na 96-dołkową płytkę zawierającą 200 μl roztworu niezamarzającego w każdym dołku. Jedna sekcja na studzienkę.
- Przechowywać w temperaturze -20 °C.
nuta: Jeśli analiza całej biopsji nie jest analizowana, należy ją przeciąć tylko częściowo. W takim przypadku skrawki muszą być przechowywane w temperaturze -20 °C, a pozostała część biopsji w temperaturze -80 °C, aby zachować ją przez dłuższy czas.
4. Barwienie immunofluorescencyjne
- Napełnij 96-dołkową płytkę 100 μl roztworu myjącego.
- Przenieść skrawki do analizy z płytki do przechowywania na nową zawierającą roztwór myjący. 1 sekcja na każdą studzienkę (4 sekcje na miejsce anatomiczne, na pacjenta: zwykle w sumie 12 sekcji na pacjenta).
- Pozostaw sekcję w roztworze myjącym na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Przenieś sekcję do innej studzienki zawierającej ten sam roztwór i powtórz pranie.
- Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl roztworu blokującego i inkubować przez co najmniej 90 minut, a maksymalnie 4 godziny w temperaturze pokojowej.
- Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała anty-PGP9.5 (poliklonalne królika, 1:1000) i anty-5G4 (monoklonalne myszy, 1:400) w roztworze roboczym.
- Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl roztworu roboczego przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować je O/N w temperaturze pokojowej.
- Zgodnie z punktem 4.3 przemyć sekcje 2 razy przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej, przy użyciu 100 μl roztworu myjącego.
- Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (sprzężone z różnymi fluoroforami): kozi anty-królik w celu wykrycia PGP9.5 (1:700) i kozi anty-myszy w celu wykrycia 5G4 (1:700) w roztworze roboczym.
- Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl roztworu roboczego przeciwciał drugorzędowych przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Od tego momentu przykryj 96-dołkową płytkę folią aluminiową, aby uniknąć bielenia fluoroforu sprzężonego z drugorzędowym przeciwciałem / przeciwciałami.
- Zgodnie z krokiem 4.3 umyć skrawki 2 razy przez co najmniej 10 minut, używając 100 μl roztworu myjącego.
- Przenieść skrawki do nowych studzienek zawierających 100 μl 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI, rozcieńczonego w stosunku 1:5 000 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS] 1x) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Zgodnie z krokiem 4.3 umyć skrawki 2 razy przez co najmniej 10 minut, używając 100 μl roztworu myjącego.
- Zamontuj sekcje na prowadnicy we właściwej pozycji, unikając nieprawidłowego składania.
- Dodaj kilka kropel podłoża montażowego na szkiełko i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
- Pozostaw szkiełka do wyschnięcia O/N przed użyciem mikroskopu konfokalnego/fluorescencyjnego.
- Przechowywać preparaty w odpowiednim pudełku w temperaturze 4 °C, unikając ekspozycji na światło. Przy dokładnym przechowywaniu sygnał będzie widoczny przez około 6 miesięcy.
nuta: Przeniesienie fragmentu z płytki 96-dołkowej zawierającej nowo pokrojone plastry do płytki 96-dołkowej zawierającej roztwór płuczący (krok 4.1) odbywa się za pomocą małej szczoteczki, która pomaga pobrać biopsję. Po przeniesieniu sekcji do pierwszej studzienki, za każdym razem, gdy plaster musi być inkubowany z innym roztworem, przenieś go z dołka do dołka za pomocą pędzla.
5. Obrazowanie immunofluorescencyjne
- Oglądaj przekroje pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym lub mikroskopem konfokalnym (powiększenie 20X, 40X lub większe, użyj kolejnych klatek z przyrostem 2 μm na planie Z-stack, aby uzyskać najlepsze wyniki).
- Rejestrowanie obrazów za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu
- Użyj odpowiedniego oprogramowania do obrazowania (tj. ImageJ) do analizy sygnałów dodatnich w sekcjach pod względem rozkładu przestrzennego i intensywności sygnału. Aby to zrobić, wykonaj czynności wymienione poniżej.
- Otwórz plik za pomocą oprogramowania ImageJ.
- Kliknij Obraz > kolor > podziel kanały, aby przeanalizować każdy kanał koloru.
- Kliknij opcję Obraz > stos > projekt Z, aby uzyskać scalenie wielu przejęć sekcji.
- Kliknij opcję Obraz > kolor > scalić kanały, aby uzyskać scalenie różnych kanałów kolorów o tym samym pozyskaniu.
Tabela 1: Wymagane rozwiązania. Lista wymaganych rozwiązań dla protokołu i krótki opis, jak go przygotować.
Roztwór przeciw zamarzaniu
(przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy) | 30% glicerolu
30% glikol etylenowy
30% dH2O
10% 2x Bufor fosforanowy |
Roztwór blokujący
(przygotuj się w tej chwili) | 4% normalna surowica kozia
1% Triton X-100
w Roztwór myjący |
Krio-protectant
(przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy) | 20% glicerol
80% roztwór Sorensena |
Wodorofosforan disodowy, roztwór
(przechowywać w temperaturze RT do 6 miesięcy) | 0,45 M wodorofosforan disodowy (Na2HPO4) w dH2O
Filtr w sterylnej butelce |
Roztwór lizyny
(przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 tygodni) | 50% 0,3M roztworu monochlorowodorku L-lizyny
50% 0,1 M roztworu Sorensena pH 7,6
pH 7,4, filtrować w sterylnej butelce |
Paraformaldehyd (PFA) 8%
(przygotować pod wyciągiem i przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca) | 2,6 M PFA w dH2O (do 55°C_do nie przekraczać 60 °C, aby uniknąć tworzenia się kwasu mrówkowego)
filtr w sterylnej butelce |
Bufor fosforanowy 2x
(przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy) | 6% roztwór fosforanu monosodowego (NaH2PO4
45% roztwór fosforanu disodowego (Na2HPO4) w dH2O |
Roztwór utrwalający PLP
(przygotuj się w tej chwili, pod wyciągiem ) | 25% Paraformaldehyd 8%
0,01 M (meta)periodynian sodu
75% roztwór lizyny |
Diwodorofosforan sodu jednowodny
(przechowywać w temperaturze RT do 6 miesięcy) | 0,52 M diwodorofosforan sodu jednowodny (NaH2PO4 * H2O) w dH2O
Przefiltrować w sterylnej butelce. |
Roztwór Sorensena
(przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca) | 2,5% roztwór fosforanu monosodowego
18,7% Roztwór fosforanu disodowego
pH 7,6, w dH2O |
Roztwór myjący
(przygotuj się w tej chwili) | 0,25 M Trizma podstawa
0,26 mln NaCl
pH 7,6, w dH2O |
Roztwór roboczy
(przygotuj się w tej chwili) | 50% roztwór blokujący
50% roztwór myjący |
