Wykorzystanie tomografii fluorescencyjnej do oceny zapalenia jelit myszy

Streszczenie

Źródło: Nowacki, T. M., et al. Tomografia za pośrednictwem fluorescencji do wykrywania i kwantyfikacji zapalenia jelit myszy związanego z makrofagami. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje technikę oceny infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego za pomocą tomografii fluorescencyjnej (FMT). Po wywołaniu zapalenia jelita grubego u myszy za pomocą siarczanu sodu dekstranu (DSS), zwierzęciu wstrzykuje się przeciwciała, które rozpoznają marker glikoproteiny F4 / 80 na infiltrowanych makrofagach w okrężnicy. Mysz jest następnie obrazowana w urządzeniu FMT, w którym sygnały fluorescencji i odbicia są rekonstruowane w trójwymiarowy obraz w celu określenia rozkładu przestrzennego i intensywności fluorescencji.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Materiały i konfiguracja eksperymentalna

1. Opieka nad zwierzętami.
   1. Użyj myszy dopasowanych płciowo i wiekowo dowolnego szczepu podatnego na DSS (np. C57BL/6) o masie ciała 20-25 g.
   2. Zaplanuj co najmniej pięć lub więcej myszy na grupę eksperymentalną i trzymaj myszy zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
   3. Zapewnij standardową dietę dla gryzoni i autoklawowaną wodę pitną ad libitum.
   4. Usuń standardową karmę i zastąp ją karmą wolną od lucerny co najmniej trzy dni przed skanowaniem, aby zmniejszyć autofluorescencję endoluminalną.
2. Indukcja ostrego zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS.
   1. Rozpuść 2 g DSS (masa cząsteczkowa ~40 000 Da) w 100 ml autoklawowanej wody pitnej, aby uzyskać 2% (w/v roztwór).
   2. Napełnij zapas napojów myszy wyłącznie roztworem DSS i oszacuj 5 ml płynu na mysz dziennie. Tę samą wodę pitną bez DSS należy dostarczyć myszom kontrolnym.
      nuta: Monitoruj myszy codziennie, aż do końca eksperymentu. Poddaj eutanazji myszy, które tracą więcej niż 20% swojej początkowej masy ciała lub które stają się w stanie agonalnym (tj. uporczywie zgarbiona postawa, zmniejszony ruch, utrudnione oddychanie, wyraźnie wyprostowana sierść) zgodnie z lokalnymi obowiązującymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt.
3. Przygotowanie tomografii fluorescencyjnej.
   1. Oznaczyć pożądane przeciwciało (np. szczurze przeciwciało anty-mysie F4/80) barwnikiem fluorescencyjnym (np. cyjanina7,_wzbudzenie λ: 750 nm,_emisja λ: 776 nm) zgodnie z opisem w protokole producenta. Oczyszczone przeciwciało należy dializować w odpowiedniej membranie dializacyjnej (wielkość porów < 50-100 kDa) w stosunku do 1 l 0,15 M chlorku sodu przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.
      1. Przenieść przeciwciało do 1 l 0,1 M_NaHCO3 i dializować przez co najmniej 2 godziny.
      2. Rozpuścić wymaganą ilość barwnika fluorescencyjnego w dimetylosulfotlenku (DMSO) (10,8 μl/mg przeciwciała) i dodać go do roztworu przeciwciała. Użyj barwnika fluorescencyjnego w 20-krotnym nadmiarze molowym, aby uzyskać stosunek barwnika do białka 1:3.
      3. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Usunąć nieznakowane przeciwciała przez dializę przeciwko 1 litrowi 0,15 M sodu lub przy użyciu kolumny odsalającej PD-10 i rozpuścić w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do stosowania in vivo.
      4. Określić końcowe stężenie przeciwciał i współczynnik znakowania za pomocą spektrofotometrii.
      5. Zmierz stężenie białka przy absorpcji 250-330 nm i rozważ dodatkowe wchłanianie przez barwnik. Skorygować maksymalną absorpcję przy 280 nm (białko) o 11% maksymalnej absorpcji przy 750 nm (następny krok) dla znakowania cyjaniną.
      6. Zmierzyć rozcieńczenie związku (zwykle 1:10) przy 250-800 nm i wyekstrahować stężenie cyjaniny7 przy 750 nm.
      7. Określ stosunek barwnika do białka jako: barwnik/przeciwciało = maksymalna absorpcja przy 750 nm / 200 000 / (maksymalna absorpcja przy 280 nm - 0,11 x maksymalna absorpcja przy 750 nm) / 170 000.
      8. Roztwór przeciwciał należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem, aby uniknąć bielenia przed wstrzyknięciem.
   2. Bezpośrednio przed wstrzyknięciem należy umieścić niezbędną objętość roztworu przeciwciał w sterylnej strzykawce i chronić ją przed światłem do czasu użycia.
   3. Określ optymalny czas wstrzyknięcia sondy i procedury skanowania, w zależności od farmakokinetyki znacznika.
   4. Znieczulij myszy za pomocą 1,5 - 2,5% wziewnego izofluranu w tlenie lub umieść je bezpiecznie w specjalnym ograniczniku do wstrzykiwania znakowanych przeciwciał do żyły ogonowej.
   5. W przypadku przeciwciał o pełnej długości należy wstrzyknąć znakowane przeciwciało co najmniej 24 godziny przed skanowaniem, na przykład w celu wizualizacji makrofagów F4/80 przeciwko mysim mięśniom w mysim zapaleniu jelita grubego. Wstrzyknąć myszom dożylnie (dożylnie) przez żyłę ogonową znakowane przeciwciało w ilości odpowiadającej 2,0 nmol barwnika.
   6. Stosować jednakowo znakowane nieswoiste przeciwciała (np. szczurzą IgG lub inny izotyp odpowiadający dziedzictwu przeciwciał pierwotnych) jako kontrolę izotypu w dawkach równoważnych dawkom specyficznej sondy.
      nuta: Wyniki skanów in vivo po wstrzyknięciu związku kontrolnego mogą służyć jako odniesienie do interpretacji konkretnych danych obrazowania sondy.
   7. Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić sierść zwierzęcia w okolicy brzucha, aby zminimalizować odbicie i absorpcję światła.

2. Wyposażenie techniczne

1. Do fluorescencji małych zwierząt należy użyć weterynaryjnego urządzenia do tomografii fluorescencyjnej (FMT) (ryc. 1).
2. Utwórz nowe badanie dla każdego projektu, klikając przycisk "nowe badanie" i dołącz do opisu badania odpowiednie znaczniki, w tym parametry obrazowania i dawki do wykorzystania w przyszłości.
3. W ramach tego badania należy utworzyć grupy badawcze zgodnie z odpowiednim projektem badania (np. dla specyficznego znacznika i kontroli izotypu niespecyficznego), klikając przycisk "nowa grupa badawcza". Wyposaż każdą badaną grupę w odpowiednią liczbę zwierząt.
4. Skalibruj system dla konstrukcji znacznikowych.
   1. Wykonaj kalibrację dla każdej partii znaczników, aby znormalizować różnice w etykietowaniu i umożliwić pomiar ilościowy na podstawie danych OI.
   2. Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta urządzenia dotyczącymi kalibracji każdego pojedynczego systemu; po wybraniu opcji "dodaj nowy znacznik" system zapewni przewodnik przez kolejne kroki. Podać rozcieńczenie zastosowanego roztworu przeciwciała i obliczone bezwzględne stężenie znacznika w sondzie.
   3. W przypadku FMT należy użyć fantomu naśladującego tkankę o określonej grubości i charakterystyce wchłaniania (przypominającego żywą tkankę) i wypełnić go określoną objętością użytego roztworu przeciwciała. Zmierz to na urządzeniu FMT.
      nuta: System wykorzysta pomiar referencyjny dostarczonej sondy, wraz z podanym stężeniem, do obliczenia bezwzględnych stężeń znaczników z przyszłych pomiarów in vivo.
5. Użyj podgrzewanej kasety badawczej o temperaturze 42 °C.
   nuta: Zapobiega to hipotermii myszy podczas badania.

3. Znieczulenie zwierząt

1. Do znieczulenia myszy należy użyć ciągłego przepływu izofluranu o stężeniu 1,5 - 2% obj. ([2-chloro-2-(difluorometoksy)-1,1,1-trifluoro-etan]) i 1,5 l_O2/min. Używaj specjalnie zaprojektowanych systemów inhalacyjnych do znieczulenia gryzoni (parownik izofluranu), aby łatwo kontrolować głębokość znieczulenia i zminimalizować narażenie personelu.
2. Umieść mysz w szczelnej komorze indukcyjnej i włącz parownik w celu dostarczenia izofluranu (100% (v/v), 5% obj. tlenu, 3 l/min). Monitoruj mysz, dopóki nie położy się i nie straci przytomności.
3. Umieść go w kasecie badawczej do tomografii, z ciągłym wdychaniem izofluranu przez stożek nosowy w dawce 100% v/v, 1,5% obj. tlenu, 1,5 l/min, aby zminimalizować artefakty ruchowe podczas badania. W przypadku zabiegów trwających dłużej niż 5 minut należy nałożyć maść na oczy myszy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki.
4. Oceń głębokość znieczulenia, sprawdzając odruchy. Połóż mysz na plecach; Jeśli znieczulenie jest wystarczające, mysz nie powinna się odwracać. Delikatnie ściśnij mysz między palcami; Jeśli znieczulenie jest wystarczające, noga nie zostanie wycofana (etap tolerancji chirurgicznej).

4. Tomografia za pośrednictwem fluorescencji

UWAGA: Dostosuj następujące szczegóły, które są specyficzne dla systemu FMT użytego w tym badaniu (zobacz Tabelę materiałów) dla alternatywnych urządzeń do obrazowania fluorescencyjnego lub systemów FMT, zgodnie z potrzebami.

1. Umieść znieczuloną mysz na plecach w kasecie z badaniami.
2. Wykonaj procedurę skanowania.
   1. Włóż kasetę do systemu obrazowania i natychmiast ją zamknij, aby zapewnić ciągłe znieczulenie. Należy wybrać odpowiednią próbę z utworzonej wcześniej grupy analitycznej. Wybierz podany znacznik z menu rozwijanego, aby upewnić się, że wartości stężenia znacznika są prawidłowo obliczone.
   2. Uzyskaj obraz odbicia fluorescencji o odpowiedniej długości fali (720 nm dla cyjaniny7) w celu zaplanowania skanowania i nakreśl pole skanowania, klikając przycisk "uzyskaj obraz".
   3. Sprawdź, czy pole skanowania pojawia się jako nakładka na obraz odbicia fluorescencji. Dopasuj go do interesującego Cię obszaru (np. okrężnicy lub brzucha), omijając powietrze lub obszary pozostałej sierści. W zależności od docelowego obrazu ustaw liczbę punktów danych obrazu w polu skanowania, wybierając spośród zgrubnej lub średniej i dokładnej rozdzielczości pola skanowania w menu po prawej stronie.
      nuta: Należy pamiętać, że dokładne pole skanowania może oferować lepszą rozdzielczość przestrzenną kosztem znacznie dłuższego czasu skanowania.
   4. Rozpocznij akwizycję danych/obrazu na wybranej długości fali, klikając "skanuj"
      nuta: Czas skanowania w przypadku średnio dokładnego skanu całego brzucha wyniesie około 5 minut; W tym czasie każdy punkt danych jest oddzielnie oświetlany przez laser wzbudzający, a uzyskana fluorescencja jest rejestrowana.
   5. Po zakończeniu skanowania wyjmij zwierzę z kasety obrazowej i pozwól zwierzęciu całkowicie dojść do siebie przed umieszczeniem go z powrotem w klatce.
   6. Powtórz FMT, jeśli uzna to za konieczne, w różnych punktach czasowych podczas eksperymentu (np. dni 0, 5 i 9 - 10 (koniec eksperymentu)), ale weź pod uwagę akumulację przeciwciał w organizmie, zwiększając w ten sposób sygnał fluorescencji tła.

5. Rekonstrukcja i interpretacja danych

1. Użyj narzędzia do rekonstrukcji odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, aby utworzyć mapy 3D rozkładu fluorescencji na podstawie surowych danych obrazowych; skany są automatycznie dodawane do narzędzia do rekonstrukcji, gdy podczas skanowania wybrana jest funkcja "dodaj do kolejki rekonstrukcji".
   1. W przeciwnym razie wybierz skany z menu rozwijanego pod odpowiednim badaniem i grupą badawczą, kliknij skan prawym przyciskiem myszy i wybierz "dodaj do rekonstrukcji".
2. W celu dalszej analizy załaduj zestaw danych do oprogramowania analitycznego. Z menu rozwijanego na górnym pasku wybierz odpowiednie badanie, a następnie wybierz grupę badawczą i pojedyncze zwierzę z menu po prawej stronie; Zostaną wyświetlone wszystkie skany wykonane dla tego zwierzęcia. Wybierz właściwe skanowanie i kliknij "załaduj."
   nuta: Rekonstrukcja 3D rozkładu znacznika pojawi się po lewej stronie jako nakładka początkowo uzyskanego obrazu odbicia fluorescencji. Model można obracać i powiększać w celu łatwiejszej analizy.
3. Zidentyfikuj ogniska akumulacji niespecyficznej etykiety (np. wątroba lub pęcherz moczowy) na zrekonstruowanych mapach 3D i odróżnij je od tkanek docelowych (np. jelita lub jelita).
4. Na górnym pasku wybierz kształt ROI najbardziej odpowiedni dla celu. Oznacz tkankę docelową jako obszary zainteresowania (ROI), umieszczając odpowiednie narzędzia pomiarowe w oprogramowaniu analitycznym; oprogramowanie zapewni intensywność fluorescencji dla ROI, a także (piko-)molowe ilości znacznika, dla którego skan został skalibrowany.
5. Wybierz całkowitą ilość znacznika w odpowiednim ROI, znormalizowaną dla wielkości ROI, jako najbardziej odpowiedni równoważnik do oceny aktywności choroby w korelacji z naciekiem zapalnym (histologia).
   nuta: Inne cechy ROI można wybrać w razie potrzeby jako reprezentatywne dla danego modelu.

Wyniki

Rysunek 1. Tomograficzna wizualizacja nacieków makrofagów w mysim zapaleniu jelita grubego.

Skany FMT u myszy z coliką i kontrolnych bez kolity, którym podano przeciwciało sprzężone z cyjaniną7 przeciwko mysim F4/80 (n = 5 na grupę). (A) Wykres słupkowy: całkowita intensywność fluorescencji w pmol barwnika została określona w ROI i przedstawio...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki
Dieta bez lucerny	Harlan Laboritories, Madison, Stany Zjednoczone	Rok 2014
Maść do oczu Bepanthen	Bayer, Leverkusen, Niemcy	80469764
Siarczan dekstranu sodu (DSS)	TdB Consulatancy, Uppsala, Szwecja	DB001
Eozyną	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy	Zobacz materiał E 4382
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Niemcy	Zobacz materiał B506
Hematoksylina	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Niemcy	HHS32-1L
Związek O.C.T. Tissue Tek	Sakura, Zoeterwonde, Holandia	Numer katalogowy: 4583	utrwalacz do analiz histologicznych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS	Lonza, Verviers, Belgia	Numer katalogowy: 4629
Chlorek sodu 0,9%	Braun, Melsungen, Niemcy	5/12211095/0411
Wodorowęglan sodu w proszku	Sigma Aldrich Deisenhofen, Niemcy	Zobacz materiał S5761
Dieta standardowa	Altromin, Lage, Niemcy	1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, Leiden, Holandia	Numer katalogowy: 4566
Hemokratyka (test z bibuły gwajakowej)	Beckmann Coulter, Niemcy	Numer katalogowy: 3060
Biotyna szczuro-anty-mysie przeciwciało anty-F4/80	Serotec, Oksford, Wielka Brytania	MCA497B
Biotyna szczur-anty-myszy anty-GR-1	BD Pharmingen, Heidelberg, Niemcy	553125
Streptawidyna-Alexa546	Sondy molekularne, Darmstadt, Niemcy	S-11225	Maksymalne wzbudzenie / emisja: 556/573nm
Przeciwciało anty-CD11b przeciwko szczurom TC	Calteg, Burlingame, Stany Zjednoczone	Czynnik R2b06
Oczyszczone przeciwciało anty-mysie F4/80	BioLegend, Londyn, Wielka Brytania	123102
DAPI (interfejs DAPI)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy	Zobacz materiał D9542
Przeciwciało anty-Ly6C szczura i myszy sprzężone z FITC	BD Pharmingen, Heidelberg, Niemcy	553104
Bufor FACS	BD Pharmingen, Heidelberg, Niemcy	342003
Cy7 NHS Ester	GE Healthcare Europe, Fryburg, Niemcy	PA17104
Test ELISA MPO	Immundiagnostik AG, Bensheim, Niemcy	K 6631B
Przeciwciało anty-mysie F4/80 znakowane Cy5.5	BioLegend, Londyn, Wielka Brytania	123127	gotowe do użycia znakowane przeciwciała (alternatywa)
Antygen przeciw myszom F4/80 PerCP-cyjaninina5.5	eBioscience, Waltham, Stany Zjednoczone	45-4801-80	gotowe do użycia znakowane przeciwciała (alternatywa)
DMSO (sulcotlenek dimetylu)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy	67-68-5
Izofluran	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy	792632
etanol	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy	64-17-5
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy	Nr kat. A4612
Buforowany roztwór soli fizjologicznej Tris (TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy	SRE0032
sprzęt
System cytometrii przepływowej FACS Calibur	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Niemcy
System obrazowania in vivo FMT 2000	PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	FMT2000
Oprogramowanie do analizy obrazowania True Quant 3.1	PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	zawarte w FMT2000
Mikroskop fluorescencyjny Leica DMLB	Leica, 35578 Wetzlar, Niemcy	DMLB (Magazyn Energii
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlin, Niemcy	Dysk twardy 2070	homogenizator ultradźwiękowy
Skalpel jednorazowy nr 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy	Z692395-10EA
Nożyczki Metzenbaum 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Niemcy	22398330
Strzykawka Luer Lock 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy	Z248010
igły do strzykawek	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Niemcy	Z192368
Tubka Sokoła 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgia	Numer katalogowy: 352070

powiedział: szt. TGL Morskiej