Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Projektowanie niestandardowego układu tablicy i produkcja
- Wygeneruj arkusz kalkulacyjny sekwencji peptydowych z odpowiadającymi im wywołaniami alleli. Tablica ma 20 wierszy i 30 kolumn i może pomieścić do 20x30=600 miejsc na peptydy. W zależności od całkowitej liczby peptydów zarejestrowanych w kroku 1.5 od jednego konkretnego dawcy i w oparciu o nasze wcześniejsze doświadczenia z dwoma przykładami, które wypróbowaliśmy, matryca 600 plamek może pomieścić wszystkie sekwencje wygenerowane z ~2 oddzielnych przypadków przeszczepu.
- Racjonalnie zaplanuj najbardziej efektywny sposób, aby dopasować zestawy peptydów do formatu 600 punktów tablicy.
- Jeśli więcej niż jeden temat może zmieścić się w jednej całej tablicy, wstaw puste wiersze po sekwencjach pierwszego dawcy, aby dopasować całkowitą liczbę wierszy, które można podzielić przez 30 (liczba miejsc w rzędzie w tablicy).
- Bezpośrednio po ostatnim pustym wierszu dla pierwszego zestawu sekwencji wklej całą kolumnę z zawartością sekwencji z drugiego przypadku przeszczepu.
- Powtarzaj te kroki, aż tablica zostanie wypełniona i nie będzie można dodać więcej obserwacji bez przekroczenia 600 miejsc. Jeśli na dole pozostały całe puste wiersze do wypełnienia, "przenieś" pusty wiersz tak, aby znalazł się między dwoma zestawami dawców. Ta duża przestrzeń pozostawiona między skrzynkami ułatwia cięcie membrany po zakończeniu syntezy - po kroku 2.2. poniżej.
- Zaprogramuj sekwencje peptydowe w kontekście układu tablicy. Program syntezatora SPOT przyjmuje format tekstowy sekwencji (jeden wiersz, jedna sekwencja peptydowa), który można uzyskać bezpośrednio, zapisując wynikowy arkusz kalkulacyjny z kroku 1.1.4 jako prosty dokument tekstowy (bez dodatkowych kolumn dla nazw alleli, pozycji aa itp.).
- Uruchom automatyczną syntezę macierzy peptydów za pomocą syntezatora SPOT. Cała operacja syntezy jest szczegółowo opisana w Kudithipudi i wsp. Zauważ, że synteza Fmoc dwóch tablic trwa ~4-5 dni.
2. Sonduj i ponownie badaj surowice odpornościowe z szeregu czasowego indywidualnego biorcy przeszczepu.
UWAGA: Tablica membranowa z 600 punktami ma wymiary ~7 cm x 13 cm. Po syntezie matryce mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej jako suche membrany przez co najmniej dwa lata, gdy są osłonięte przed bezpośrednim światłem. Unikaj nadmiernego fałdowania membrany, aby zachować jej długowieczność przy wielokrotnym użyciu.
- Ponownie uwodnić układ membranowy etanolem i uwidocznić plamki peptydowe wybarwione Ponceau S.
- Ponownie uwodnić układ błonowy przenoszący peptydy, postępując zgodnie z krokową procedurą zoptymalizowaną w Li i wsp.
- Zanurz membranę matrycy w 20 ml 100% etanolu.
- Dodać 20 ml wody destylowanej, aby rozcieńczyć roztwór do 50% etanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
- Trzykrotnie zmienić roztwór zanurzeniowy na 40 ml 100% wody i za każdym razem inkubować przez 15 minut.
- Przemyć w odpowiednim buforze roboczym, np. 20 ml TBST (sól fizjologiczna buforowana trisem z 0,1%), trzy razy po 5 minut.
- Barwienie matrycy metodą Puceau S w celu wizualizacji syntetycznych peptydów
- Dodaj 20 ml wstępnie sformułowanego roztworu Ponceau S bezpośrednio do uwodnionej matrycy i inkubuj przez ~30 s z wytrząsaniem.
- Przelej wodę destylowaną w sposób ciągły po membranie, aby usunąć plamy z tła w kolorze Puceau S. Podczas tego procesu mogą stać się widoczne plamy peptydowe o czerwonym kolorze.
- Oddziel części tablicy dla każdego dawcy, ostrożnie przecinając sekcje matrycy dla poszczególnych przypadków. Zaznacz orientację każdej tablicy.
- Tablica wstępnie blokowa.
- Zablokuj membranę w 20 ml 5% beztłuszczowego mleka rozpuszczonego w buforze TBST. Ten roztwór na bazie mleka dodatkowo odplami kolor Pąsek S. Wymień bufor mleka kilka razy, aby uzyskać jak najwyraźniejsze obrazy peptydów.
- Do celów archiwizacyjnych należy wykonać zdjęcie obrazu tablicy Ponceau S za pomocą ręcznej kamery (przykład na rysunku 1).
- Kontynuować blokowanie błony w 5% mleku beztłuszczowym w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z kołysaniem.
- Inkubować matrycę z surowicą antytransplantacyjną.
nuta: Należy zauważyć, że zjawisko znane jako prozon lub efekt Hooka może wynikać z zależnej od dopełniacza interferencji w analizie przeciwciał w surowicy. Aby obejść ten problem, można rozważyć opcjonalny etap wstępnej obróbki surowicy za pomocą kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) lub inaktywacji termicznej próbek surowicy.
- Usunąć bufor blokujący i przemyć membranę 20 ml TBST trzy razy następnego dnia przez 5 minut za każdym razem.
- Dodać 20 μl surowej surowicy biorcy do 20 ml 2,5% mleka w buforze TBST i inkubować z membraną przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej. Należy zauważyć, że w tej początkowej rundzie sondowania zaleca się, aby najpierw użyć ostatniej surowicy po przeszczepie (lub prawdopodobnie najbardziej uczulonej surowicy) w szeregu czasowym. Opiera się to na założeniu, że wcześniejsze próbki z tej serii, szczególnie z punktów czasowych przed przeszczepem, mają mniejszą różnorodność alloprzeciwciał, które mają tendencję do rozwijania się z czasem. W ten sposób można wyraźnie odróżnić każdą możliwość zakłóceń sygnału wynikających z "przeniesienia" między rundami sondowania od naprawdę rozwiniętej reaktywności alloprzeciwciał spowodowanej odpowiedzią immunologiczną przeciwko przeszczepowi.
- Przemyć matrycę za pomocą 20 ml TBST i inkubować ją z przeciwciałem drugorzędowym.
- Umyj membranę trzy razy przez 10 minut za każdym razem.
- Inkubować z kozim przeciwciałem anty-ludzkim IgG-HRP (peroksydaza chrzanowa) w rozcieńczeniu 1:10 000 w buforze TBST uzupełnionym 1% mlekiem przez kolejne 2 godziny.
- Umyj i rozwiń plamę.
- Za każdym razem myć membranę trzykrotnie TBST przez 10 minut.
- Przeprowadzić wzmocnioną chemiluminescencję (ECL) przy użyciu 5 ml roztworu luminolu świeżo zmieszanego z 5 ml roztworu nadtlenku w celu rozwinięcia membrany (przez 1 min).
- Wizualizacja sygnałów ECL za pomocą odpowiedniego imagera (np. ChemiDoc Imaging Systems lub Azure C600).
- Zeskanuj i określ ilościowo plamę.
- Zapisz wywołane obrazy (Rysunek 2, dolny obraz) i przeprowadź kwantyfikację intensywności plamki.
3. Porównaj reaktywność surowicy w klinicznych szeregach czasowych.
- Rozebrać tablicę.
- W tym momencie membrana powinna być przez cały czas mokra.
- Usunąć membranę przez inkubację z 20 ml dostępnego w handlu buforu do oddzielania w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie przemyć membranę TBST trzy razy przez 10 minut każdy. Następnie powtórz kroki blokowania (krok 3.2) i sondowania (krok 3.3), używając innej surowicy pacjenta pobranej w innym punkcie czasowym.
- Membrana z izolacją blokową.
Uwaga: Po usunięciu izolacji membrana może być ponownie wykorzystana do kolejnej rundy sondowania innej surowicy od tego samego pacjenta w szeregu czasowym.
- Zablokuj membranę za pomocą 5% buforu mleka, jak poprzednio (patrz krok 2.2).
- Ponownie zbadaj inną surowicę antywirusową z tego samego szeregu czasowego (powtórz kroki od 2.3-2.6; przykład na rysunku 2, górny obraz).
nuta: Usunięta matryca może być następnie użyta do ponownego zbadania innej próbki surowicy. Ponieważ peptydy są walencyjnie sprzężone z macierzyą nośną błony, wykazaliśmy, że matryca może być ponownie wykorzystana przez maksymalnie 20 rund cykli strippingu i ponownego sondowania bez utraty wydajności.
