Wykrywanie krążących przeciwciał anty-glikanowych za pomocą drukowanej matrycy glikanów

Streszczenie

Źródło: Olivera-Ardid, S. et al., Drukowana tablica glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.J. Vis. Exp.(2019 rok)

Ten film demonstruje technologię drukowanej macierzy glikanowej do analizy krążących przeciwciał anty-glikanowych w surowicy myszy. Przeciwciała w surowicy oddziałują ze specyficznymi glikanami na chipie, co potwierdza się za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie skanowania fluorescencyjnego.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Produkcja glikochipów

1. Przygotowanie mikromacierzy
   1. Wydrukować glikany (50 mM) i polisacharydy (10 μg/ml) w 300 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 8,5) w 6 powtórzeniach na szkiełkach szklanych derywatyzowanych N-hydroksysukcynimidami, używając bezkontaktowej macierzy robotycznej (objętość kropli ~ 900 pL). Każdy slajd zawiera 4 różne bloki podtablic (rysunek 1A, w kolorach) powtórzone 6 razy. Każda pojedyncza podtablica składa się ze 112 różnych plamek glikanów, w tym kontrolnych (8 rzędów × 14 kolumn) (rysunek 1B).
      nuta: Informacje dotyczące glikanów przedstawiono w Tabeli 1. Biblioteka glikanów używana do drukowania mikrochipów jest wynikiem długotrwałego wysiłku syntetycznego zespołu IBCh; Przykłady syntezy opisano w powiązanych publikacjach. Biblioteka glikanów zawierała antygeny grup krwi i niektóre z najczęściej występujących końcowych oligosacharydów, a także podstawowe motywy ssaków N i O sprzężonych z N i O, glikolipidów, antygeny węglowodanowe związane z nowotworem i polisacharydy z bakterii chorobotwórczych.
   2. Inkubować szkiełka w wilgotnym pojemniku (wilgotność względna ~70%) w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 1 godzinę.
   3. Mikromacierze blokujące: inkubować szkiełka przez 1,5 godziny z buforem blokującym w temperaturze pokojowej (100 mM kwas borowy, 25 mM etanoloamina, 0,2% (v/v) Tween-20 w ultraczystej wodzie).
   4. Umyj glikochip ultraczystą wodą i wysusz go powietrzem.
2. Kontrola jakości glikochipów
   1. Analizować dwie mikromacierze z każdej partii przy użyciu 1 mg/ml roztworu złożonej immunoglobuliny (, zawierającej immunoglobuliny: IgG, IgM i IgA), 10 μg/ml roztworu biotynylowanych kozich immunoglobulin ludzkich jako przeciwciała drugorzędowego (IgM + IgG + IgA), a następnie 1 μg/ml roztworu odpowiedniego fluorescencyjnego koniugatu streptawidyny (za pomocą protokołu opisanego poniżej, patrz krok 2).
   2. Zeskanuj i przeanalizuj glikochipy (patrz krok 3, analiza macierzy glikanów).
   3. Używaj partii mikromacierzy z korelacją wewnątrz- i międzychipową wyższą niż 0,9.

2. Technika Glycan Array

1. Przygotować następujące roztwory wodne (w wodzie ultraczystej) i przechowywać je w temperaturze pokojowej (25 °C):
   1. Bufor 1: 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), 1% (v/v) Tween-20 i 0,01% (w/v) azydek sodu (NaN₃).
   2. Bufor 2: 1% (w/v) BSA w PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 i 0,01% (w/v) NaN₃.
   3. Bufor 3: 0,1% (v/v) Tween-20 w PBS.
   4. Bufor 4: 0,001% (v/v) Tween-20 w PBS.
2. Przygotowanie glikochipa i próbki
   1. Umieść pojemnik ze szkiełkami na stole, aż osiągną temperaturę pokojową (25 °C).
      nuta: Używaj bezpudrowych rękawiczek lateksowych. Glikochipem należy manipulować za pomocą dolnej części szkiełka podstawowego, w której znajduje się kod kreskowy. Kod kreskowy pomoże Ci zidentyfikować prawą stronę, unikając kontaktu z powierzchnią, na której drukowane są glikany.
   2. Otwórz pudełko, weź glikochip i umieść go w komorze inkubacyjnej (25 °C), już kondycjonowanej mokrą bibułą filtracyjną w celu utrzymania stałej wilgotności wewnątrz komory.
   3. W międzyczasie rozcieńczyć surowicę myszy Buffer-1 (1:20) w probówkach o pojemności 1,5 ml. Homogenizować roztwór surowicy (5 s) za pomocą mieszalnika wirowego.
      nuta: Objętość potrzebna do całkowitego pokrycia pojedynczej powierzchni glikochipa wynosi około 1 ml.
   4. Po homogenizacji inkubować rozcieńczoną surowicę w temperaturze 37 °C przez 10 minut w łaźni wodnej, aby uniknąć agregacji immunoglobulin. Odwirować probówki przez 3 minuty w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 25 °C, zebrać supernatant i wyrzucić wstrząśnięty materiał.
   5. Ostrożnie umieścić glikochip w komorze inkubacyjnej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 25 °C z 1 ml buforu-3 w celu usunięcia wszelkich pozostałości materiału na powierzchni glikochipa.
   6. Trzymaj glikochip w pozycji pionowej i przemyj go kilkoma kroplami Buffer-3 za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Ostrożnie usunąć bufor z powierzchni glikochipa za pomocą bibuły filtracyjnej.

3. Reakcja: wiązanie przeciwciał

1. Umieścić glikochip w komorze inkubacyjnej. Rozprowadzić rozcieńczoną próbkę surowicy na powierzchni glikochipa za pomocą mikropipety. Inkubować z mieszaniem orbitalnym (30 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny. Upewnij się, że cały suchy obszar powierzchni glikochipa jest pokryty rozcieńczoną próbką surowicy za pomocą końcówki pipety.
2. Usunąć nadmiar próbki i zanurzyć glikochip na 5 minut w buforze 3 w temperaturze 25 °C. Następnie przenieś glikochip do pojemnika z buforem-4 (5 min) i na koniec umyj (5 min) glikochip ultraczystą wodą. Odwirować glikochip przez 1 minutę w temperaturze 175 x g i temperaturze 25 °C w celu usunięcia cieczy.

4. Wykrywanie: przeciwciało wtórne

1. Umieścić glikochip w komorze inkubacyjnej. Rozprowadzić na powierzchni glikochipa roztwór (5 μg/ml) koziego anty-mysiego (IgG + IgM) sprzężonego z biotyną w buforze 2. Inkubować z mieszaniem orbitalnym (30 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
2. Usuń frakcję niezwiązaną i powtórz etapy mycia.
3. Po odwirowaniu inkubować glikochip w ciemności w temperaturze 25 °C przez 45 minut (30 obr./min) z 2 μg/ml odpowiedniego roztworu streptawidyny znakowanego fluorochromem (w buforze 2).
4. W ciemności usuń niezwiązaną frakcję i powtórz etapy mycia.
5. Wysuszyć glikochip powietrzem.
   nuta: Glycochip należy zeskanować tak szybko, jak to możliwe. Ale jeśli nie można wykonać skanowania natychmiast po barwieniu, glikochipy można przechowywać w chłodnym i suchym miejscu w ciemności.

3. Analiza tablicy glikanów

1. Skanowanie macierzy
   1. Pozostaw glikochip na stole, aż osiągnie temperaturę pokojową w ciemności. W tym samym czasie włącz skaner slajdów i laser (długość fali wzbudzenia 633 nm).
   2. Trzymając mikromatrycę, wsuń glikochip do szczeliny, aż dotknie tyłu.
   3. Zeskanuj glikochip ("uruchom łatwe skanowanie") i zapisz skan jako ". TIFF".

Tabela 1: Lista glikanów, ich wiązanie z naturalnymi krążącymi przeciwciałami (IgM + IgG) myszy BALB/c (n = 20), wyrażone we względnych jednostkach fluorescencji (RFU) jako mediana ± MAD, oraz liczba zwierząt przekraczających granicę odcięcia (≥4000 RFU). Ta tabela została odtworzona z Bello-Gil, D. et al. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie (nie w skali) konfiguracji, drukowania i analizy macierzy glikanów.(A) Drukowane mikroczipy są opracowywane z biblioteką 419 różnych struktur glikanowych, a następnie wykrywane za pomocą odpowiedniego, znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowego. Każdy slajd zawiera 4 różne bloki podtablic (w kolorach), powtórzone 6 razy. Każda poj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
przeciwciała
Biotynylowane kozy anty-ludzkie Igs	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Kod #: 31782
Biotynylowane kozie przeciwciała IgM + IgG	Thermo Fisher Naukowy	Kod #: 31807
sprzęt
Układ robotyczny sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG, Berlin, Niemcy	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Tacka na plamy (szkiełkowa komora inkubacyjna)	Simport, Beloeil, QC, Kanada	Numer kierunkowy #: M920-2
wirówka	Eppendorf, Hamburg, Niemcy	Nr kat. #: 5810 R
Pipety	Gilson, Middleton, Wisconsin, Stany Zjednoczone	http://www.gilson.com/en/Pipette/
Skaner slajdów	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	ScanArray GX Plus
Inkubator z wytrząsaniem	Cole-Parmer, Staffordshire, Wielka Brytania	Nr ref. #: SI50
Próbki biologiczne
Surowice myszy BALB/c	W tym artykule	Nie dotyczy
Preparat złożonej immunoglobuliny ()	Immuno-Gem, Moskwa, Rosja	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemikalia, odczynniki i glikany
Biblioteka glikanów	Instytut Chemii Bioorganicznej (IBCh), Moskwa, Rosja	Nie dotyczy
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,	Numer referencyjny #: A9418
Etanoloaminy	Sigma-Aldrich	Nr kat. #: 411000
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)	Merck Chemicals & Life Science S.A., Madryt, Hiszpania	Ref. #: 655204
Sól fizjologiczna buforowana fosforem (PBS)	VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Hiszpania	Nr kat. #: E404
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	Nr ref. #: S2002
Koniugat streptawidyny Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. #: S21381
Koniugat streptawidyny Cy5	GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Wielka Brytania	Ref. #: PA45001
Materiałów
Szkiełka szklane odchodione N-hydroksysukcynimidem H	Schott-Nexterion, Jena, Niemcy	Ref. #: 1070936
Bibuła filtracyjna Whatman	Sigma-Aldrich	Ref. #: WHA10347509
Probówki 1,5 ml	Eppendorf	Ref. #: 0030120086
Oprogramowanie i algorytmy
System analizy mikromacierzy ScanArray Express	PerkinElmer powiedział:	http://www.per kinelmer.com/microarray

powiedział: