$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Projektowanie slajdu tablicy i układu płyty źródłowej
- Pod nagłówkiem "Zaplanuj układ slajdów" w interfejsie ArrayNinja kliknij link odpowiadający używanej drukarce mikromacierzowej.
nuta: ArrayNinja został zaprogramowany tak, aby naśladować ruch robota dwóch powszechnie używanych drukarek mikromatrycowych (patrz Tabela 1). Kompatybilność z innymi macierzami można skonfigurować na życzenie.
- Kliknij wewnątrz okna dialogowego "Płyta obciążeniowa", wpisz "pusty" i kliknij "enter". Zobacz rysunek 1, aby zobaczyć zrzut ekranu modułu projektowego ArrayNinja.
- Dostosuj średnicę plamki do 275 μm, a odstępy między plamkami do 375 μm. Dostosuj pozostałe ustawienia (Bloki płytek/rząd płyt, Łączna liczba rzędów płytek, repliki, cechy w y, Super Arrays, krówki SuperA; patrz Rysunek 1), aby dostosować sposób wyświetlania funkcji na szkiełku mikrotablicy.
nuta: Średnica plamki jest określana przez rozmiar pinu mikromacierzy. Po dostosowaniu tych ustawień slajd kreskówkowy będzie aktualizowany w czasie rzeczywistym. Użyj tego rysunku, aby zobaczyć, jak każde ustawienie modyfikuje ostateczny układ slajdu.
- Po sfinalizowaniu układu obiektów na slajdzie najedź kursorem myszy na każdy unikatowy obiekt i wprowadź identyfikator elementu w wyskakującym oknie dialogowym.
nuta: Identyfikatory elementów mogą składać się z cyfr, liter lub kombinacji. Jest to wymagane tylko w przypadku unikatowych elementów, a okno dialogowe nie pojawi się po wybraniu replikacji.
- Po przypisaniu identyfikatora wszystkim unikalnym obiektom kliknij przycisk "wypełnij". Wprowadź nazwę układu slajdu i kliknij "wydrukuj swoją płytę", aby zapisać. Otworzy się nowa strona wyświetlająca liczbę 384-dołkowych płytek źródłowych potrzebnych do wytworzenia wybranego projektu szkiełka oraz tabelę odwzorowującą fizyczną lokalizację każdej cechy, która ma zostać załadowana do płytki źródłowej.
nuta: Zapamiętaj tę nazwę, ponieważ będzie ona używana do przywoływania tego projektu podczas analizowania danych z mikromacierzy. Kliknięcie przycisku "wydrukuj swoją płytę" powoduje zapisanie układu w ArrayNinja.
2. Wytwarzanie mikromacierzy
- Przygotowanie płyty źródłowej
- Użyj mapy wygenerowanej za pomocą ArrayNinja, aby utworzyć 384-dołkową płytkę źródłową.
UWAGA: Szczegółowe opisy peptydów wyszukiwanych na tej platformie można znaleźć w innym miejscu.
- Umieść 1 - 2 μl każdej cechy (np. biotynylowanego peptydu histonowego) w odpowiednim dołku 384-dołkowej płytki źródłowej (płytek).
nuta: Biotynylowane peptydy histonowe są zwykle deponowane w roztworach podstawowych 200 - 400 μM, co odpowiada 10 do 25-krotnemu nadmiarowi molowemu peptydu do miejsc wiązania streptawidyny w jednym miejscu macierzy. Oblicza się to za pomocą równania:
gdzie V jest objętością dostarczaną przez pin, [P] jest stężeniem drukowanej cechy, NA jest liczbą Avogadro, a S jest powierzchnią plamki. C jest pokryciem szkiełka, wyrażonym jako liczba cząsteczek streptawidyny na jednostkę powierzchni pomnożona przez trzy (średnia liczba dostępnych miejsc wiązania streptawidyny). V i C są uzyskiwane przez odpowiednich producentów. Inne cechy mogą wymagać różnych stężeń w zależności od wielkości biomolekuły, w przypadku której stłoczenie może być problemem. Zakres stężeń druku dla każdego nowego typu cechy powinien zostać przetestowany empirycznie w celu określenia optymalnego stężenia druku.
- Rozcieńczyć każdą cechę 10-krotnie za pomocą 1x bufora drukującego uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Obracać płytkę (płytki) źródłową o wymiarach 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
nuta: Włączenie biotyny znakowanej fluoresceiną (5 μg/μl) do bufora drukarskiego jest zalecane jako kontrola plam i jako pomoc wizualna ułatwiająca prawidłowe wyrównanie matrycy podczas analizy (patrz rysunek 3).
- Protokół drukowania (Rysunek 2A – B).
- Przygotuj matrycę, opróżniając pojemnik na odpady i napełniając pojemnik z roztworem myjącym i pojemnik nawilżacza sterylną wodą destylowaną.
- Wprowadź parametry używane do zaprojektowania slajdu w ArrayNinja (Rysunek 1) do programu sterującego drukarką mikromacierzową.
- Za pomocą programu sterującego drukarką mikromacierzy ustaw procedurę prania na 1-sekundowe pranie z jednym zanurzeniem. Ustaw ustawienia po praniu, aby ponownie zanurzyć szpilki 5 razy po każdym praniu. Ustaw wilgotność na 60%.
nuta: Optymalna konfiguracja zmywania może się różnić w zależności od używanej drukarki z mikromacierzą. Optymalna konfiguracja zanurzania szpilek po praniu może się różnić w zależności od używanej drukarki mikromacierzy.
- Włóż funkcjonalizowane szkiełka (np. szkło pokryte streptawidyną) do płyt podłoża i umieść wszystkie płyty w podnośniku płytowym. Włóż płytę źródłową (płyty) do uchwytu (uchwytów) na talerz (talerzy) i umieść w podnośniku płyt źródłowych.
- Kliknij "drukuj". Monitoruj proces drukowania przez kilka rund osadzania cech, aby upewnić się, że wszystkie ustawienia zmywania i zanurzania są prawidłowe. Po zakończeniu drukowania wyjmij płyty z podłożem z tablicy.
nuta: W przypadku gdy duże nakłady nie pozwalają na wykonanie etapów blokowania w ciągu jednego dnia, wydrukowane preparaty można inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc. Inkubuj szkiełka obok małej zlewki z wodą w kartonowym pudełku zamkniętym folią.
- Zablokować szkiełka buforem blokującym na 30 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
- Umyć szkiełka 2 x 10 min w temperaturze pokojowej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,6 z mieszaniem. Wysuszyć szkiełka, wirując w wirówce do szkiełek mikromatrycowych przez 30 s w temperaturze pokojowej.
nuta: Do jednoczesnej obróbki dużej liczby szkiełek można zastosować wysokowydajną komorę do mycia szkiełek mikroskopowych, która umożliwia równoległe mycie 50 szkiełek.
- W przypadku szkiełek przeznaczonych do dzielenia woskiem, należy przejść do sekcji 2.1. W przypadku wszystkich innych wzorów szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem i wilgocią.
nuta: Wydrukowane biotynylowane peptydy histonowe są stabilne przez co najmniej 6 miesięcy, jeśli są przechowywane w ten sposób.
2. Partycjonowanie slajdów mikromacierzy
- Hydrofobowy długopis woskowy (rysunek 2C)
- Nałóż wosk wokół obszarów, które zawierają elementy, za pomocą pisaka do wosku. Pozostaw wosk do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut przed przejściem do sekcji 3.
nuta: Po zablokowaniu plamki matrycy mogą być bardzo trudne do uwidocznienia wzrokowo. Projekt szkiełka od ArrayNinja można wydrukować w skali i wykorzystać jako prowadnicę do nakładania wosku.
- Uszczelka silikonowa (rysunek 2D)
- Zdejmij przezroczystą folię z tylnej części uszczelki matrycy i umieść klej stroną do dołu na szkiełku mikromatrycy.
- Przytrzymaj uszczelkę na miejscu przez 5 sekund przed przejściem do sekcji 3.
- Odcisk wosku (rysunek 2E)
- W przypadku szkiełek przeznaczonych do dzielenia woskiem, wydrukuj szkiełko testowe na zwykłym szkle przy użyciu 10% BSA. Użyj tego slajdu testowego, aby zoptymalizować prowadnice drukarki woskowej lub ustawienia matrycy, aby upewnić się, że wszystkie funkcje będą znajdować się w komorach wosku.
- Podgrzej drukarkę woskową do 85 °C, aż cały wosk całkowicie się rozpuści, około 30 minut.
- Włóż szkiełko zadrukowaną stroną do dołu i dociśnij suwak do końca do prawej prowadnicy na drukarce mikromacierzy. Pociągnij dźwignię do góry, aby forma zetknęła się z powierzchnią suwaka. Przytrzymaj przez 2 s.
nuta: Czas utrzymywania można zmienić, aby uzyskać optymalną grubość obrzeża wosku.
- Szybko zdejmij szkiełko i sprawdź wzrokowo brzegi wosku, aby upewnić się, że wszystkie studzienki są zamknięte i że krawędzie nie są tak grube, aby naruszać miejsca. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w sposób chroniony przed wilgocią i światłem.
nuta: Czas utrzymywania można wydłużyć lub skrócić, aby uzyskać grubsze lub cieńsze krawędzie.
3. Hybrydyzacja przeciwciała histonowego PTM z mikromacierzą peptydową
- Przygotować bufor hybrydyzacyjny (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20).
- Zrównoważyć szkiełko w buforze hybrydyzacyjnym za pomocą naczynia do hybrydyzacji. Całkowicie pokryć całe szkiełko buforem hybrydyzacyjnym i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej z małą prędkością.
- Przygotować roztwór zawierający rozcieńczone przeciwciało histonowe PTM w buforze hybrydyzacyjnym.
nuta: W przykładowych danych zarówno przeciwciało histonowe #1, jak i przeciwciało #2 rozcieńczono w stosunku 1:1,000 w buforze hybrydyzacyjnym. Jako punkt wyjścia zaleca się zakres rozcieńczenia podobny do tego, który stosuje się do immunoblottingu.
- Inkubować matrycę z roztworem przeciwciała przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Wyjąć roztwór przeciwciała i przemyć matrycę 3 razy przez 5 minut w temperaturze 4 °C zimnym PBS o pH 7,6.
- Przygotować rozcieńczenie 1:5 000 - 1:10 000 przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym w buforze hybrydyzacyjnym.
- Inkubować matrycę z roztworem przeciwciał drugorzędowych przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. Usunąć roztwór przeciwciała wtórnego i przemyć szkiełko do mikromacierzy 3 razy przez 5 minut w temperaturze 4 °C z PBS o pH 7,6. Zanurz mikromacierz w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 0,1 PBS, pH 7,6, aby usunąć nadmiar soli w temperaturze pokojowej. Wysuszyć szkiełko w wirówce do szkiełek do mikromacierzy w temperaturze pokojowej.
- Zeskanuj szkiełko za pomocą skanera z mikromatrycą o rozdzielczości 25 μm lub wyższej, postępując zgodnie z protokołem skanowania zalecanym przez producenta skanera mikromatrycowego.
nuta: Jeśli obecny jest znacznik biotyny znakowany fluoresceiną, zeskanuj zarówno kanał zielony (np. 488 nm, em: 509 nm), jak i kanał odpowiadający przeciwciału drugorzędowemu sprzężonemu z barwnikiem fluorescencyjnym, zwykle czerwonemu (np. 635 nm, em: 677 nm). Celem skanowania jest uzyskanie jednokanałowych plików .tif, które można scalić w jeden plik .png.
