Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

1. Projektowanie slajdu tablicy i układu płyty źródłowej

1. Pod nagłówkiem "Zaplanuj układ slajdów" w interfejsie ArrayNinja kliknij link odpowiadający używanej drukarce mikromacierzowej.
   nuta: ArrayNinja został zaprogramowany tak, aby naśladować ruch robota dwóch powszechnie używanych drukarek mikromatrycowych (patrz Tabela 1). Kompatybilność z innymi macierzami można skonfigurować na życzenie.
2. Kliknij wewnątrz okna dialogowego "Płyta obciążeniowa", wpisz "pusty" i kliknij "enter". Zobacz rysunek 1, aby zobaczyć zrzut ekranu modułu projektowego ArrayNinja.
3. Dostosuj średnicę plamki do 275 μm, a odstępy między plamkami do 375 μm. Dostosuj pozostałe ustawienia (Bloki płytek/rząd płyt, Łączna liczba rzędów płytek, repliki, cechy w y, Super Arrays, krówki SuperA; patrz Rysunek 1), aby dostosować sposób wyświetlania funkcji na szkiełku mikrotablicy.
   nuta: Średnica plamki jest określana przez rozmiar pinu mikromacierzy. Po dostosowaniu tych ustawień slajd kreskówkowy będzie aktualizowany w czasie rzeczywistym. Użyj tego rysunku, aby zobaczyć, jak każde ustawienie modyfikuje ostateczny układ slajdu.
4. Po sfinalizowaniu układu obiektów na slajdzie najedź kursorem myszy na każdy unikatowy obiekt i wprowadź identyfikator elementu w wyskakującym oknie dialogowym.
   nuta: Identyfikatory elementów mogą składać się z cyfr, liter lub kombinacji. Jest to wymagane tylko w przypadku unikatowych elementów, a okno dialogowe nie pojawi się po wybraniu replikacji.
5. Po przypisaniu identyfikatora wszystkim unikalnym obiektom kliknij przycisk "wypełnij". Wprowadź nazwę układu slajdu i kliknij "wydrukuj swoją płytę", aby zapisać. Otworzy się nowa strona wyświetlająca liczbę 384-dołkowych płytek źródłowych potrzebnych do wytworzenia wybranego projektu szkiełka oraz tabelę odwzorowującą fizyczną lokalizację każdej cechy, która ma zostać załadowana do płytki źródłowej.
   nuta: Zapamiętaj tę nazwę, ponieważ będzie ona używana do przywoływania tego projektu podczas analizowania danych z mikromacierzy. Kliknięcie przycisku "wydrukuj swoją płytę" powoduje zapisanie układu w ArrayNinja.

2. Wytwarzanie mikromacierzy

1. Przygotowanie płyty źródłowej
   1. Użyj mapy wygenerowanej za pomocą ArrayNinja, aby utworzyć 384-dołkową płytkę źródłową.
      UWAGA: Szczegółowe opisy peptydów wyszukiwanych na tej platformie można znaleźć w innym miejscu.
   2. Umieść 1 - 2 μl każdej cechy (np. biotynylowanego peptydu histonowego) w odpowiednim dołku 384-dołkowej płytki źródłowej (płytek).
      nuta: Biotynylowane peptydy histonowe są zwykle deponowane w roztworach podstawowych 200 - 400 μM, co odpowiada 10 do 25-krotnemu nadmiarowi molowemu peptydu do miejsc wiązania streptawidyny w jednym miejscu macierzy. Oblicza się to za pomocą równania:
      
      gdzie V jest objętością dostarczaną przez pin, [P] jest stężeniem drukowanej cechy, NA jest liczbą Avogadro, a S jest powierzchnią plamki. C jest pokryciem szkiełka, wyrażonym jako liczba cząsteczek streptawidyny na jednostkę powierzchni pomnożona przez trzy (średnia liczba dostępnych miejsc wiązania streptawidyny). V i C są uzyskiwane przez odpowiednich producentów. Inne cechy mogą wymagać różnych stężeń w zależności od wielkości biomolekuły, w przypadku której stłoczenie może być problemem. Zakres stężeń druku dla każdego nowego typu cechy powinien zostać przetestowany empirycznie w celu określenia optymalnego stężenia druku.
   3. Rozcieńczyć każdą cechę 10-krotnie za pomocą 1x bufora drukującego uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Obracać płytkę (płytki) źródłową o wymiarach 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
      nuta: Włączenie biotyny znakowanej fluoresceiną (5 μg/μl) do bufora drukarskiego jest zalecane jako kontrola plam i jako pomoc wizualna ułatwiająca prawidłowe wyrównanie matrycy podczas analizy (patrz rysunek 3).
2. Protokół drukowania (Rysunek 2A – B).
   1. Przygotuj matrycę, opróżniając pojemnik na odpady i napełniając pojemnik z roztworem myjącym i pojemnik nawilżacza sterylną wodą destylowaną.
   2. Wprowadź parametry używane do zaprojektowania slajdu w ArrayNinja (Rysunek 1) do programu sterującego drukarką mikromacierzową.
   3. Za pomocą programu sterującego drukarką mikromacierzy ustaw procedurę prania na 1-sekundowe pranie z jednym zanurzeniem. Ustaw ustawienia po praniu, aby ponownie zanurzyć szpilki 5 razy po każdym praniu. Ustaw wilgotność na 60%.
      nuta: Optymalna konfiguracja zmywania może się różnić w zależności od używanej drukarki z mikromacierzą. Optymalna konfiguracja zanurzania szpilek po praniu może się różnić w zależności od używanej drukarki mikromacierzy.
   4. Włóż funkcjonalizowane szkiełka (np. szkło pokryte streptawidyną) do płyt podłoża i umieść wszystkie płyty w podnośniku płytowym. Włóż płytę źródłową (płyty) do uchwytu (uchwytów) na talerz (talerzy) i umieść w podnośniku płyt źródłowych.
   5. Kliknij "drukuj". Monitoruj proces drukowania przez kilka rund osadzania cech, aby upewnić się, że wszystkie ustawienia zmywania i zanurzania są prawidłowe. Po zakończeniu drukowania wyjmij płyty z podłożem z tablicy.
      nuta: W przypadku gdy duże nakłady nie pozwalają na wykonanie etapów blokowania w ciągu jednego dnia, wydrukowane preparaty można inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc. Inkubuj szkiełka obok małej zlewki z wodą w kartonowym pudełku zamkniętym folią.
   6. Zablokować szkiełka buforem blokującym na 30 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
   7. Umyć szkiełka 2 x 10 min w temperaturze pokojowej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,6 z mieszaniem. Wysuszyć szkiełka, wirując w wirówce do szkiełek mikromatrycowych przez 30 s w temperaturze pokojowej.
      nuta: Do jednoczesnej obróbki dużej liczby szkiełek można zastosować wysokowydajną komorę do mycia szkiełek mikroskopowych, która umożliwia równoległe mycie 50 szkiełek.
   8. W przypadku szkiełek przeznaczonych do dzielenia woskiem, należy przejść do sekcji 2.1. W przypadku wszystkich innych wzorów szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem i wilgocią.
      nuta: Wydrukowane biotynylowane peptydy histonowe są stabilne przez co najmniej 6 miesięcy, jeśli są przechowywane w ten sposób.

2. Partycjonowanie slajdów mikromacierzy

1. Hydrofobowy długopis woskowy (rysunek 2C)
   1. Nałóż wosk wokół obszarów, które zawierają elementy, za pomocą pisaka do wosku. Pozostaw wosk do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut przed przejściem do sekcji 3.
      nuta: Po zablokowaniu plamki matrycy mogą być bardzo trudne do uwidocznienia wzrokowo. Projekt szkiełka od ArrayNinja można wydrukować w skali i wykorzystać jako prowadnicę do nakładania wosku.
2. Uszczelka silikonowa (rysunek 2D)
   1. Zdejmij przezroczystą folię z tylnej części uszczelki matrycy i umieść klej stroną do dołu na szkiełku mikromatrycy.
   2. Przytrzymaj uszczelkę na miejscu przez 5 sekund przed przejściem do sekcji 3.
3. Odcisk wosku (rysunek 2E)
   1. W przypadku szkiełek przeznaczonych do dzielenia woskiem, wydrukuj szkiełko testowe na zwykłym szkle przy użyciu 10% BSA. Użyj tego slajdu testowego, aby zoptymalizować prowadnice drukarki woskowej lub ustawienia matrycy, aby upewnić się, że wszystkie funkcje będą znajdować się w komorach wosku.
   2. Podgrzej drukarkę woskową do 85 °C, aż cały wosk całkowicie się rozpuści, około 30 minut.
   3. Włóż szkiełko zadrukowaną stroną do dołu i dociśnij suwak do końca do prawej prowadnicy na drukarce mikromacierzy. Pociągnij dźwignię do góry, aby forma zetknęła się z powierzchnią suwaka. Przytrzymaj przez 2 s.
      nuta: Czas utrzymywania można zmienić, aby uzyskać optymalną grubość obrzeża wosku.
   4. Szybko zdejmij szkiełko i sprawdź wzrokowo brzegi wosku, aby upewnić się, że wszystkie studzienki są zamknięte i że krawędzie nie są tak grube, aby naruszać miejsca. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w sposób chroniony przed wilgocią i światłem.
      nuta: Czas utrzymywania można wydłużyć lub skrócić, aby uzyskać grubsze lub cieńsze krawędzie.

3. Hybrydyzacja przeciwciała histonowego PTM z mikromacierzą peptydową

1. Przygotować bufor hybrydyzacyjny (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20).
2. Zrównoważyć szkiełko w buforze hybrydyzacyjnym za pomocą naczynia do hybrydyzacji. Całkowicie pokryć całe szkiełko buforem hybrydyzacyjnym i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej z małą prędkością.
3. Przygotować roztwór zawierający rozcieńczone przeciwciało histonowe PTM w buforze hybrydyzacyjnym.
   nuta: W przykładowych danych zarówno przeciwciało histonowe #1, jak i przeciwciało #2 rozcieńczono w stosunku 1:1,000 w buforze hybrydyzacyjnym. Jako punkt wyjścia zaleca się zakres rozcieńczenia podobny do tego, który stosuje się do immunoblottingu.
4. Inkubować matrycę z roztworem przeciwciała przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Wyjąć roztwór przeciwciała i przemyć matrycę 3 razy przez 5 minut w temperaturze 4 °C zimnym PBS o pH 7,6.
5. Przygotować rozcieńczenie 1:5 000 - 1:10 000 przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem fluorescencyjnym w buforze hybrydyzacyjnym.
6. Inkubować matrycę z roztworem przeciwciał drugorzędowych przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. Usunąć roztwór przeciwciała wtórnego i przemyć szkiełko do mikromacierzy 3 razy przez 5 minut w temperaturze 4 °C z PBS o pH 7,6. Zanurz mikromacierz w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 0,1 PBS, pH 7,6, aby usunąć nadmiar soli w temperaturze pokojowej. Wysuszyć szkiełko w wirówce do szkiełek do mikromacierzy w temperaturze pokojowej.
7. Zeskanuj szkiełko za pomocą skanera z mikromatrycą o rozdzielczości 25 μm lub wyższej, postępując zgodnie z protokołem skanowania zalecanym przez producenta skanera mikromatrycowego.
   nuta: Jeśli obecny jest znacznik biotyny znakowany fluoresceiną, zeskanuj zarówno kanał zielony (np. 488 nm, em: 509 nm), jak i kanał odpowiadający przeciwciału drugorzędowemu sprzężonemu z barwnikiem fluorescencyjnym, zwykle czerwonemu (np. 635 nm, em: 677 nm). Celem skanowania jest uzyskanie jednokanałowych plików .tif, które można scalić w jeden plik .png.

Rysunek 1: Moduł projektowy ArrayNinja. Zrzut ekranu modułu projektowego ArrayNinja jest pokazany w przerywanej linii. Panel sterowania (u góry) pokazuje wszystkie parametry, które można zmienić w drukarce mikromacierzy. Po dostosowaniu tych parametrów kreskówkowy obraz układu slajdów (w lewym dolnym rogu) jest aktualizowany w czasie rzeczywistym. Po ustawieniu układu użytkownik może najechać kursorem myszy na poszczególne miejsca, aby wprowadzić unikalne identyfikatory obiektów. Na podstawie tych danych wejściowych użytkownika ArrayNinja tworzy mapę położenia każdej cechy w płycie źródłowej (po prawej) źródłowej, potrzebnej do wytworzenia określonego układu slajdów z mikrotablicą.

Rysunek 2: Wytwarzanie mikromacierzy. (A) Wytwarzanie mikromacierzy peptydów histonowych na szkiełkach mikroskopowych pokrytych streptawidyną przy użyciu kontaktowej drukarki mikromatrycowej. (B) Mikromacierze wykonane z 3 podtablic siatki cech peptydowych o wymiarach 48 x 48. Rozdzielenie (C) 3 podtablic za pomocą hydrofobowego pisaka woskowego, (D) 2 podtablic za pomocą kleju silikonowego i (E) 48 podtablic za pomocą odcisku wosku. Wszystkie przedstawione mikromacierze są wykonane przy użyciu szkiełek mikroskopowych o wymiarach 25 x 75 mm.

Rysunek 3: Moduł analizy ArrayNinja. Pokazany jest zrzut ekranu modułu analitycznego ArrayNinja. Panel sterowania (w lewym górnym rogu) pokazuje wszystkie parametry, które można dostosować, aby zwizualizować tablicę, znaleźć punkty i wyrównać siatkę na obrazie tablicy. Najechanie kursorem myszy na obiekt powoduje wyświetlenie powiększonego widoku (prawy górny róg) i wyświetlenie wyskakującego okienka zawierającego informacje identyfikacyjne powiązane z tą funkcją (u dołu). Punkty odniesienia wybrane do korekcji tła są oznaczone kolorem pomarańczowym. Obiekty, które mają zostać wyłączone z dalszej analizy, są oznaczone kolorem białym. ArrayNinja zawiera funkcję wyszukiwania tekstowego, która podświetla pasujące obiekty na żółto, jak pokazano w przykładzie dla H4K16.