1. Immunolokalizacja
UWAGA: Procedura immunolokalizacji fluorescencyjnej opiera się na sekwencyjnym użyciu dwóch przeciwciał. Przeciwciało pierwszorzędowe jest podnoszone przeciwko specyficznemu antygenowi docelowemu. Przeciwciało drugorzędowe jest wywoływane specyficznie przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu, a w przypadku technik fluorescencyjnych jest sprzężone z fluoroforem (FITC [izotiocyjanian fluoresceiny] w tym specyficznym protokole). Przeciwciało pierwszorzędowe zostanie użyte do wykrycia antygenu docelowego w próbce, a przeciwciało drugorzędowe zostanie użyte do oznaczenia miejsca, w którym przeciwciało pierwszorzędowe połączyło się z próbką po zmyciu nadmiaru przeciwciała pierwszorzędowego. Kontrole są ważną częścią tego testu i zawsze muszą być przeprowadzane w celu zapewnienia dokładności obserwacji. Jedna studzienka na szkiełku powinna być zarezerwowana do użycia jako kontrola ujemna, w której podstawowe leczenie przeciwciałami zostanie pominięte, a zatem pod koniec eksperymentu nie należy zaobserwować żadnego sygnału. Do doświadczenia musi zostać włączona kontrola pozytywna poprzez potraktowanie jednego studzienka przeciwciałem, którego oznakowanie jest już znane i pewne. Kontrolę dodatnią stosuje się w celu potwierdzenia skuteczności znakowania przeciwciał drugorzędowych i warunków reakcji, natomiast kontrolę ujemną bada się swoistość przeciwciał drugorzędowych.
- Przygotuj komorę inkubacyjną, umieszczając zwilżone ręczniki papierowe na dnie pudełka z końcówkami do pipet i owijając je folią aluminiową (Rysunek 1B-1E). Umieścić szkiełka w komorze inkubacyjnej.
- Odpipetować pipetą 50 μl kropli na 8 mm studzienki roztworu blokującego (5% beztłuszczowego mleka w proszku (w/v) w 1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS]) i inkubować przez 10 minut. Usunąć roztwór blokujący i przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie PBS przez 10 minut.
- Przygotować pierwszorzędowe roztwory przeciwciał (patrz Tabela 1), przeciwciało 1:5 (v/v) w roztworze blokującym; oszacować około 40 μl na 8 mm dołka.
nuta: Stężenie przeciwciała musi być dostosowane zgodnie z protokołem producenta.
- Wykonać końcowe płukanie wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) przez 5 minut, nigdy nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia studzienek.
- Odpipetować pierwotny roztwór przeciwciała do studzienek reakcyjnych. Roztwór blokujący pipety do studzienek kontrolnych.
- Zamknąć komorę inkubacyjną i odstawić na 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie na noc w temperaturze 4 °C. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała, 1% w roztworze blokującym (v/v) około 40 μl na studzienkę. Przykryj go folią aluminiową.
- Przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie PBS przez 10 minut, a następnie przez dodatkowe 10 minutddH2O. Upewnij się, że na studzienkach nie jest widoczny żaden ślad roztworu blokującego lub osadów.
- Odpipetować wtórny roztwór przeciwciała do wszystkich studzienek. Od teraz chroń zjeżdżalnie przed światłem.
- Inkubować przez 3–4 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej.
- Przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie przez 10 minut PBS, a następnie ponownie przepłukać przez 10 minut ddH2O.
- Nałóż kroplę kalkofluoru (1:10 000 (w/v) świetlówka jaśniejsza 28 w PBS) do każdej studzienki. Bez mycia nałóż kroplę środka montażowego (patrz Tabela materiałów) na każdą studzienkę i umieść szkiełko nakrywkowe (Rysunek 2H).
- Obserwuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, wyposażonego w soczewki 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 i 100x/1,40, użyj filtrów UV (do barwienia kalkofluorem) i FITC, aby wykryć odpowiednio ścianę komórkową i immunolokalizację (ryc. 2I). Użyj następujących długości fal: wzbudzenie/emisja (nm) 358/461 dla UV i 485/530 dla FITC.
- Aby uzyskać lepszą wizualizację wyników, nałóż na siebie oba obrazy za pomocą ImageJ lub podobnego.
Tabela 1: Lista użytecznych przeciwciał monoklonalnych. Powyższa tabela stanowi przykład dostępnych przeciwciał wraz z informacjami o ich celach i miejscach, w których można je kupić.
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
powiedział:
| nazwa | powinowactwo | Dostępne pod adresem |
| Zobacz materiał LM2 | Białko arabinoglaktanu | Sondy roślinne (Leeds, Wielka Brytania) |
| Zobacz materiał LM5 | Pektyny |
| Zobacz materiał LM6 | Arabinan |
| Zobacz materiał LM7 | Homogalakturonowy |
| Zobacz materiał LM8 | Xylogalacturonan (Język angielski) |
| Zobacz materiał LM13 | (1-5)-a-L-ARABINAN |
| Zobacz materiał LM14 | Białko arabinoglaktanu |
| Zobacz materiał LM16 | Przetworzony Arabinan - RG-I |
| Zobacz materiał LM18 | Homogalakturonowy |
| Zobacz materiał LM19 | Homogalakturonowy |
| LM20 | Homogalakturonowy |
| Zobacz materiał LM26 | GALAKTAN-ROZGAŁĘZIONY |
| Zobacz materiał LM30 | Białko arabinoglaktanu |
| JIM5 | Homogalakturonan o niskiej zawartości estryfikacji metylowej | CCRC (Gruzja, Stany Zjednoczone) |
| JIM7 | Homogalakturonan o wysokiej estryfikacji metylowej |
| JIM4 | Białko arabinoglaktanu |
| JIM8 | Białko arabinoglaktanu |
| JIM13 | Białko arabinoglaktanu |
| JIM15 | Białko arabinoglaktanu |
| JIM16 | Białko arabinoglaktanu |
| JIM20 | Ekstensyna |
| MAC207 | Białko arabinoglaktanu |
