Za pomocą testu ELISA typu kanapkowego w celu określenia zawartości glikoproteiny immunogennej w szczepionce

Streszczenie

Źródło: Jallet, C. et al., Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie.J. Vis. Exp. (2020)

Ten film prezentuje pośredni test immunoenzymatyczny lub test immunoenzymatyczny ELISA, przeznaczony do oceny poziomów immunogennej glikoproteiny w szczepionkach. Płytka testowa, zawierająca przeciwciała specyficzne dla glikoproteiny, jest inkubowana z seryjnie rozcieńczanymi próbkami szczepionki, w tym szczepionkami referencyjnymi i testowymi, a następnie przeprowadza się test immunologiczny w celu ilościowego określenia zawartości glikoproteiny w badanej szczepionce.

Protokół

1. Środki ostrożności

UWAGA: Ta metoda ma zastosowanie zarówno do żywego wirusa wścieklizny (RABV), jak i szczepionki inaktywowanej.

1. Stosuj dobrą praktykę laboratoryjną i procedury bezpieczeństwa.
2. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym jednorazowy płaszcz, rękawice, maski, okulary itp.
3. Podczas miareczkowania żywego wirusa należy użyć komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
   1. Każdy materiał mający kontakt z próbkami (odczynniki, roztwory myjące itp.) należy traktować jako materiał zakaźny.
   2. Zanieczyszczony materiał należy poddać obróbce, zanurzając go w roztworze wybielacza (2,5% podchlorynu sodu) na 30 minut w celu odkażenia.
4. Z chemikaliami należy obchodzić się zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi.

2. Przygotowanie

1. Tam, gdzie to możliwe, należy używać odczynników klasy analitycznej.
2. Przygotować świeże roztwory buforu powlekającego/buforu węglanowego, buforu pasywacyjnego, rozcieńczalnika i buforu cytrynianu (tabela 1), przefiltrować przez filtry 0,45 lub 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden dzień przed użyciem, aby zachować ich czystość analityczną.
3. Odczynniki powinny osiągnąć temperaturę pokojową (+18 °C do +25 °C) na 30 minut przed użyciem i homogenizować przez delikatne mieszanie przed użyciem.

3. Uczulenie na mikropłytki

UWAGA: Użyj 96-dołkowych płytek do testów immunologicznych adsorpcji, które są zoptymalizowane do wiązania dużych ilości immunoglobulin (np. patrz Tabela Materiałów).

1. Do każdego dołka dodać 200 μl przeciwciała monoklonalnego (mAb-D1) rozcieńczonego w buforze węglanowym.
   nuta: Eksperymentalnie określono optymalne stężenie około 1 μg/ml, które odpowiada w przybliżeniu rozcieńczeniu 1/2000 oczyszczonego mAb-D1. To zalecane stężenie jest wskazane dla każdej partii mAb-D1 i musi być okresowo weryfikowane z kontrolą dodatnią.
2. Przykryć płytkę folią przylepną i inkubować mikropłytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze.
3. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do pojemnika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
4. Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na chłonnym papierze w temperaturze pokojowej przez 5 minut.

4. Pasywacja mikropłytek

1. Do każdej studzienki dodać 300 μl buforu pasywacyjnego.
2. Przykryć płytkę folią klejącą i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
3. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do pojemnika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
4. Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na chłonnym papierze w temperaturze pokojowej przez 1 min.
   nuta: Mikropłytka może być natychmiast użyta lub przechowywana szczelnie zamknięta w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.

5. Test ELISA

UWAGA: Do ustalenia krzywej kontrolnej szczepionki referencyjnej, Krok 5.3 nie jest wymagany; do miareczkowania testowanej szczepionki konieczne są wszystkie kroki od 5.1 do 5.6.

1. Mycie mikropłytki uczulonej
   1. Do każdej studzienki dodać 300 μl buforu do mycia.
   2. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do pojemnika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
   3. Powtórz kroki 5.1.1 i 5.1.2 jeszcze pięć razy, aby dokładnie umyć uczuloną płytkę.
   4. Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbującej w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
2. Rozcieńczenia szczepionki referencyjnej dla krzywej kontrolnej
   1. Odtworzyć szczepionkę wzorcową (antygen walidacyjny partia 09) w 1 ml wody destylowanej odpowiadającej stężeniu 10 μg/ml glikoproteiny wirusa wścieklizny.
   2. Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenie odtworzonej szczepionki wzorcowej w rozcieńczalniku, aby osiągnąć 1 μg/ml glikoproteiny wirusa wścieklizny.
   3. Przygotować 6 seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń tej szczepionki wzorcowej w rozcieńczalniku, jak wskazano w Tabeli 1.
   4. Rozprowadzić 200 μl rozcieńczalnika w dwóch egzemplarzach (studzienki 1H/2H), aby służyły jako ślepa próba.
   5. Rozprowadzić 200 μl na studzienkę każdego rozcieńczenia szczepionki referencyjnej w dwóch egzemplarzach (studzienki G1/G2 do A1/A2).
3. Rozcieńczenia badanej szczepionki w celu jej miareczkowania
   1. Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenie badanej szczepionki w rozcieńczalniku.
   2. Przygotować 7 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń badanej szczepionki w rozcieńczalniku, jak wskazano w Tabeli 2.
   3. Rozprowadzić 200 μl na studzienkę każdego badanego rozcieńczenia szczepionki w dwóch egzemplarzach (studzienki H3/H4 do A3/A4).
4. Inkubacja/Mycie płytki ELISA
   1. Przykryć mikropłytkę folią klejącą i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   2. Usunąć folię, ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biornika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
   3. Do każdej studzienki dodaj 300 μl buforu do mycia.
   4. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
   5. Powtórzyć kroki 5.4.3 i 5.4.4 pięć razy w celu usunięcia niezwiązanego antygenu i zachowania trimerów białka G związanych z powlekanym przeciwciałem (mAb D1).
   6. Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na chłonnym papierze w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
5. Wiązanie mAb-D1 sprzężonego z peroksydazą
   1. Rozprowadzić 200 μl na studzienkę zalecanego rozcieńczenia (1/2000) mAb-D1 znakowanego peroksydazą w rozcieńczalniku (przybliżone stężenie 1 μg/ml). Zalecane stężenie jest wskazane dla każdej partii mAb-D1 i musi być okresowo weryfikowane z kontrolą dodatnią.
   2. Przykryć mikropłytkę folią klejącą i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   3. Usunąć folię, ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biornika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
   4. Dodać do każdej studzienki 300 μl buforu do płukania.
   5. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.
   6. Powtórzyć kroki 5.5.4 i 5.5.5 pięć razy, aby usunąć niezwiązane przeciwciało znakowane peroksydazą (mAb D1).
   7. Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na chłonnym papierze w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
6. Rewelacja przy użyciu substratu-chromogenu
   1. Rozprowadzić 200 μl na studzienkę roztworu substratu chromogenu.
   2. Uszczelnić mikropłytkę folią i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Rozwija się żółto-pomarańczowy kolor, którego intensywność jest proporcjonalna do ilości związanych przeciwciał znakowanych peroksydazą (mAb D1).
   3. Zatrzymać reakcję, dodając 50 μl roztworu zatrzymującego na studzienkę.
   4. Ostrożnie wytrzeć spód mikropłytki i umieścić ją w spektrofotometrze w celu określenia gęstości optycznej (OD) przy 492 nm wszystkich użytych studzienek: kontroli ujemnej (ślepa), szczepionki referencyjnej i badanej szczepionki.
   5. Zbieraj dane OD w formacie pliku .xls lub .xlsx do analizy.

Tabela 1. użyte w teście.

i odczynniki	preparat
Bufor do powlekania (Bufor węglanowy 50mM pH = 9,6)	Dodać węglan sodu 50 mM (Na2CO 3-10H2O) do wodorowęglanu sodu 50 mM (NaHCO3) do uzyskania pożądanego pH (około 1/10 objętości wodorowęglanu sodu)
Bufor pasywacyjny	0,3% albumina surowicy bydlęcej (BSA, frakcja V), 5% sacharoza w buforze węglanowym 50 mM pH 9,6
10x Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH = 7 (PBS 10x)	NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO 4-12H2O 11,33 g, KH2PO4 2g w 1L wody destylowanej. Dostosuj pH = 7 za pomocą 4N NaOH
Bufor do mycia	0,05% animacji w 1x PBS
Rozcieńczalnika	0,5% albuminy surowicy bydlęcej (frakcja V), 0,05% tween w 1x PBS (dostosować pH do 7 z powodu zakwaszenia przez BSA)
Bufor cytrynianowy pH-5,6 (dla substratu peroksydazy)	11,67 g cytrynian trisodowy-2H2O (Na3C6H5O7-2H 20), 2,17 g Kwas cytrynowy-1H20 w 1L wody destylowanej
Roztwór substratowo-chromogenowy	50 mg tabletki orto-fenylenodiaminy, 0,1% Nadtlenek wodoru 30% (110 obj.) w 25 ml buforu cytrynianu pH 5,6
Roztwór zatrzymujący (Kwas siarkowy 4N)	10 ml H2SO4 36N w 80 ml schłodzonej wody destylowanej. Rozcieńczanie należy przeprowadzić w łaźni lodowej

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II	ThermoFisher Naukowy	10445753	W przypadku miareczkowania żywego wirusa
Przezroczyste, niesterylne płytki immunologiczne 96-dołkowe z płaskim dnem, 400 μl, MAXISORP	ThermoFisher Naukowy	439454	Dobry do wiązania się z załadowanym przeciwciałem
Wyposaż Labo Polipropylenowy wyciąg laboratoryjny	ThermoFisher Naukowy	12576606	Do przygotowania kwasu siarkowego
Tabliczka immunologiczna Strong Adsorpcja MAXISORP Płaskie dno Cóż, F96	Holender	Numer katalogowy: 55303	Dobry do wiązania się z załadowanym przeciwciałem
Taśma uszczelniająca do mikropłytek (100 arkuszy)	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 15036
Czytnik mikropłytek jednomodowych Sunrise	TECAN
Wytrząsarka-inkubator do mikropłytek	Holender	441504
Myjka do mikropłytek Wellwash	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 5165000
Pipeta wielokanałowa (30-300 μL) 12 kanałów	ThermoFisher Naukowy	4661180N
Pipety jednokanałowe (Zestaw 2: Pipety Finnpipettes F2 0,2-2 μL mikro, 2-20 μL, 20-200 μL i 100-1000 μL)	ThermoFisher Naukowy	4700880