$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Sprzężenie nanocząstek magnetycznych (MNP)
- Stosować komercyjną procedurę sprzęgania i odczynniki do łączenia MNP z przeciwciałami (Abs) (zwykle 1 mg). Stosuje się nanocząstki tlenku żelaza z kwasem karboksylowym jako grupami reaktywnymi.
- Jeśli przeciwciała mają objętość większą niż 0,5 ml, należy skoncentrować za pomocą koncentratora 100K. Wirować z prędkością 2 000 x g przez 3-5 minut.
- Na zakończenie procedury, po dodaniu 10 μl buforu hartującego, przenieść MNP do probówki o wymiarach 12 mm x 75 mm i dodać 3 ml buforu do przemywania / przechowywania. Umieścić rurkę w środkowym otworze separatora magnetycznego i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
- Sprawdź, czy wszystkie MNP zebrały się z boku probówki, a następnie ostrożnie odpipetuj cały płyn. Dodaj 3 ml świeżego buforu do mycia/przechowywania i umieść z powrotem w magnesie.
- Po kilku godzinach sprawdź, czy MNP zostały zebrane z boku probówki, a następnie odpipetuj płyn. Użyć 2 ml buforu do przemywania/przechowywania w celu ponownego zawieszenia MNP i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Sprawdzić, czy Abs są sprzężone z MNP, znakując je odpowiednim fluorescencyjnym fragmentem przeciwciała Fab (np. kozim przeciwciałem anty-mysim, jeśli używa się mysiego monoklonalnego Ab do wychwytywania, jak opisano w sekcji 2) i uruchomić na cytometrze przepływowym.
2. Znakowanie przeciwciał sprzężonych z MNP
- Połączyć 60 μl (3,9 x 1012 cząstek) MNP (na warunek) i 5 μl (z 200 μg/ml roztworu handlowego) znakowane fragmenty Fab, specyficzne dla izotypu wychwytywanego Ab w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
- Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut z ciągłym mieszaniem.
- Wstępnie zwilżyć koncentrator 100K 300 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wirować w mikrowirówce przy 1 500 x g przez 5 minut.
- Oczyść oznakowane kompleksy na kolumnie 100K. Wirować mieszaninę z kroku 2.2 w mikrowirówce o stężeniu 1 500 x g przez 5 minut, przemyć 200 μl PBS i odzyskać początkową objętość.
3. Użycie znakowanych kompleksów Ab-MNP do wychwytywania interesujących cząstek (pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, EVs)
- Inkubować wstępnie znakowane MNP 60 μl (3,9 x 1012 cząstek) z przygotowaniem EV (100 μl).
- Przygotuj preparaty EV różnymi metodami. Tutaj należy oczyścić EV na gradientach sacharozy, zebrać je z osocza ubogiego w płytki krwi za pomocą odczynników do wytrącania egzosomów lub wyizolować bezpośrednio z osocza.
nuta: Optymalne proporcje muszą być określone dla każdego eksperymentu i są zależne od stężenia EV w preparacie. Frakcja MNP-Ab powinna być o ~10,6 wyższa w stosunku do stężenia frakcji EV.
- Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C dla pojazdów elektrycznych.
- Dodaj 2,5% mysiej IgG / ludzkiej IgG, aby zablokować wiązanie Fc, delikatnie wirować, inkubować 3-5 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać zalecane przez producenta lub ograniczone stężenia każdego wykrytego Abs i inkubować dodatkowe 20 minut w temperaturze pokojowej.
4. Oddzielenie EV wychwyconych przez MNP od niezwiązanych przeciwciał za pomocą kolumn magnetycznych
- Przygotuj magnetyczną kolumnę separacyjną do użycia, umieszczając ją w magnesie separatora.
- Wstępnie zwilżyć kolumnę 500 μl buforu do przemywania (2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS). Pozwolić, aby bufor płuczący przepłynął przez kolumnę.
- Dodaj kompleksy MNP-EV do kolumny i pozwól, aby cała ciecz przez nią przepłynęła. Dodać 500 μl buforu do płukania do kolumny, pozwalając na przejście całej objętości.
- Powtórz mycie buforem do płukania jeszcze 2 razy.
- Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w rurze o wymiarach 12 mm x 75 mm w celu zebrania zatrzymanych kompleksów MNP-EV. Pozostaw kolumnę w rurze z dala od magnesu na 3 minuty. Dodaj 200 μl PBS i pozwól kulkom spłynąć grawitacyjnie, dodaj kolejne 200 μl PBS i po elucji utrwal 200 μl 4% paraformaldehydu.
nuta: Paraformaldehyd jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy i powinien być obsługiwany w wentylowanym kapturze i należy nosić rękawice.
- Aby określić ilościowo pojedyncze EV, użyj ustawień wolumetrycznych w próbniku o wysokiej przepustowości (HTS) lub tuż przed akwizycją dodaj dobrze wymieszane kulki cytometrii przepływowej.
5. Analiza EV wychwyconych przez MNP za pomocą cytometru przepływowego
- Rozgrzej cytometr przepływowy przez 30 minut.
- Uruchom koraliki kontroli jakości.
- Ustaw próg fluorescencji MNP lub oznaczonych EV. Użyj PBS z filtrem 0,22 μm jako progu, aby zmniejszyć "szum" tła. Ustaw próg, dostosowując napięcie PMT na poziomie, na którym filtrowany PBS nie daje żadnych zdarzeń lub daje bardzo mało zdarzeń.
- Uruchamiaj próbki na niskim poziomie. (Użyj dodatkowego filtra liniowego 0,04 μm dla płynu osłonowego umieszczonego szeregowo za standardowym filtrem osłonowym 0,2 μm, aby jeszcze bardziej wyeliminować fałszywe zdarzenia).