$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie próbki biologicznej
UWAGA: Wybrane miejsce anatomiczne i objętość pobrania krwi są pozostawione do uznania każdego badacza z osobna i nie będą miały wpływu na wynik testu. Jednak po ich uzyskaniu z próbkami należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
- Przygotowanie próbek surowicy
- Pobrać żądaną objętość krwi do preferowanej probówki do pobrania krwi i pozostawić ją do krzepnięcia przez co najmniej 30 minut.
- Odwirowywać próbkę przez 10 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej.
- Natychmiast usunąć surowicę i oznaczenie zawartości lub podać porcję do probówek do mikrowirówek z polipropylenu i przechowywać próbki w temperaturze ≤ -20 °C.
- Przygotowanie próbek osocza
- Pobrać żądaną objętość krwi za pomocą probówek do pobierania krwi pokrytych kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
- Wirować przez 10 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut od pobrania.
- Natychmiast usunąć osocze i oznaczenie zawartości lub porcjować do probówek do mikrowirówek z polipropylenu i przechowywać próbki w temperaturze ≤ -20 °C.
- Przygotowanie próbek supernatantu do kultur tkankowych
- Odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 1 500 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń.
- Zebrać supernatant i natychmiast oznaczyć lub podwielokrotność do probówek do mikrowirówek z polipropylenu i przechowywać w temperaturze ≤ -20 °C.
- Rozmrażanie zamrożonych próbek biologicznych
- Całkowicie rozmrozić wszystkie wcześniej zamrożone próbki biologiczne na lodzie i na krótko przed użyciem przetoczyć wir. Unikaj więcej niż 2 cykli zamrażania/rozmrażania.
nuta: Próbki użyte w tym protokole uzyskano poprzez hodowlę mysich splenocytów BALB/c (1 x 106 komórek w temperaturze 37 °C + 5% CO2 w różnych warunkach: niestymulowane, LPS (100 ng / ml), αCD3 (1 μg / ml powlekane płytką) + αCD28 (1 μg / ml rozpuszczalne), PMA (20 ng / ml) + jonomycyna (500 ng / ml). Supernatanty hodowlane zebrano po 48 godzinach i przetworzono zgodnie z opisem w sekcji 1.3.
2. Przygotowanie odczynnika
- Przygotowanie wstępnie zmieszanych kulek unieruchomionych przeciwciałami
- Wstępnie zmieszaną butelkę z kulkami należy poddać sonifikacji przez 1 minutę w kąpieli sonikołacyjnej w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przez 30 s przed użyciem. Jeśli kąpiel sonicyjna nie jest dostępna, należy wydłużyć czas wirowania do 1 minuty.
- Przygotowanie buforu do płukania
- Doprowadź 20x bufor do płukania (20x PBS z 1% Tween-20) dostarczony z zestawem do temperatury pokojowej i wiruj, aby wprowadzić wszystkie sole do roztworu.
- Rozcieńczyć 25 ml 20x buforu do płukania w 475 ml wody dejonizowanej. Niewykorzystane porcje należy przechowywać w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez okres do jednego miesiąca.
- Przygotowanie matrycy B (do stosowania wyłącznie z próbkami surowicy i osocza)
- Dodać 5,0 ml buforu testowego (PBS z 1% BSA) dołączonego do zestawu do butelki zawierającej liofilizowaną matrycę B. Odczekać co najmniej 15 minut do całkowitego rozpuszczenia, a następnie dobrze wymieszać. Resztki rozpuszczonej matrycy B można przechowywać w temperaturze ≤ -70 °C przez okres do jednego miesiąca.
3. Przygotowanie standardowe
UWAGA: Każdy analit w tym panelu ma najwyższe standardowe stężenie 10 000 pg/ml.
- Dodać 250 μl buforu testowego, aby rozpuścić liofilizowany standardowy koktajl cytokin Th dla myszy. Wymieszać przez krótkie wirowanie i pozostawić fiolkę w temperaturze pokojowej na 10 minut.
- Przenieś standardowy koktajl do polipropylenowej probówki wirówkowej oznaczonej "C7". Będzie to używane jako najwyższy standard.
- Oznacz 6 probówek do mikrowirówek z polipropylenu jako C6, C5, C4, C3, C2 i C1.
- Dodać 75 μl buforu testowego do każdej z tych probówek.
- Przenieś 25 μl najwyższej klasy C7 do probówki C6 i dobrze wymieszaj, wirując. Będzie to standard C6.
- Kontynuuj wykonywanie seryjnych rozcieńczeń 1:4, używając nowej końcówki pipety dla każdej probówki, aby dodać 25 μl poprzedniego wzorca do 75 μl buforu testowego w następnej najniższej probówce wzorcowej, a następnie wirować w celu uzyskania wzorców C5, C4, C3, C2 i C1. Użyj buforu testowego jako wzorca 0 pg/ml (C0).
4. Rozcieńczenie próbki
UWAGA: Wstępne eksperymenty pilotażowe z użyciem tego testu z wieloma rozcieńczeniami mogą być wymagane w celu określenia najbardziej odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia dla określonego zestawu próbek biologicznych. Odpowiedni współczynnik rozcieńczenia pozwoli na obliczenia stężenia dla próbki, które mieszczą się w granicach krzywej wzorcowej. Poniższe kroki mają charakter orientacyjny i mogą wymagać empirycznego określenia w zależności od rodzaju próbki.
- Rozcieńczyć próbki surowicy lub osocza 2-krotnie buforem do oznaczania (np. rozcieńczyć 50 μl próbki 50 μl buforu do oznaczania) w polipropylenowych probówkach wirówkowych.
nuta: Jeśli wymagane jest dalsze rozcieńczanie próbki, rozcieńczenia należy przeprowadzić za pomocą matrycy B zamiast buforu testowego, aby zapewnić dokładny pomiar. Dodanie próbek surowicy lub osocza bez rozcieńczenia spowoduje niską dokładność testu i może zatkać płytkę filtracyjną. Macierz B składa się z połączonej surowicy myszy pozbawionej endogennych celów testu. Jest stosowany jako rozcieńczalnik do próbek surowicy lub osocza, aby uniknąć efektów matrycy, o których wiadomo, że wpływają na czułość analityczną testów immunologicznych.
- Badać próbki sklarowanych nad natryskiem do hodowli komórkowych bez rozcieńczania.
nuta: Poziomy analitu mogą się znacznie różnić w zależności od próbki. W razie potrzeby rozcieńczyć próbki sklarowanego osadu, stosując świeże przygotowanie odpowiadającego im podłoża do hodowli komórkowych lub buforu do oznaczania.
5. Procedura testowa
UWAGA: Test można przeprowadzić na polipropylenowych płytkach filtracyjnych, probówkach do mikrofluorescencji aktywowanych sortowaniem komórek (FACS) lub mikropłytkach V-bottom. Procedura oznaczania płytek filtracyjnych jest zalecana ze względu na dobrą konsystencję między próbkami, solidność testu i łatwość obsługi. Ta procedura wymaga jednostki filtracji próżniowej do mycia (dostarczonej przez użytkownika końcowego).
- Przed użyciem należy odczekać, aż wszystkie odczynniki ogrzeją się do temperatury pokojowej (20 - 25 °C).
- Płytkę filtracyjną należy umieszczać na odwróconej pokrywie płytki przez cały czas podczas przygotowania do testu i etapów inkubacji w taki sposób, aby spód płytki nie dotykał żadnych powierzchni, ponieważ może to spowodować wyciek.
- Utrzymuj płytkę w pozycji pionowej podczas całej procedury testowania, w tym etapów mycia, aby uniknąć utraty kulek.
- Trzymaj płytkę w ciemności lub owiń folią aluminiową na wszystkich etapach inkubacji.
- Uruchom wszystkie wzorce i próbki jako duplikaty ułożone na płycie w kolejności sekwencyjnej.
- Wstępnie zwilż płytkę filtracyjną, dodając 100 μl 1x buforu do płukania do każdej studzienki i pozostaw na 1 minutę w temperaturze pokojowej (jeśli używasz mikropłytki z dnem filtra).
- Usunąć objętość bufora za pomocą kolektora próżniowego (5 - 10 s). Nie przekraczaj 10 " Hg próżni. Zetrzyj nadmiar buforu do mycia od spodu talerza, dociskając talerz do stosu czystych ręczników papierowych. Umieść płytkę na odwróconej pokrywie płyty.
nuta: Kroki 5.1 - 5.2 można pominąć, jeśli test jest wykonywany przy użyciu mikropłytki V-bottom lub mikroprobówek FACS.
- W przypadku próbek supernatantu z hodowli komórkowych dodać 25 μl buforu testowego do wszystkich studzienek. Dodać 25 μl każdego wzorca do studzienek wzorcowych. Dodać 25 μl każdej próbki do dołków na próbki.
- W celu pomiaru próbek surowicy lub osocza dodać 25 μl matrycy B do studzienek wzorcowych. Dodać 25 μl buforu do oznaczania do dołków na próbki. Dodać 25 μl każdego wzorca do studzienek wzorcowych. Dodać 25 μl każdej rozcieńczonej próbki surowicy lub osocza do dołków na próbki.
- Mieszaj kulki przez 30 sekund. Dodaj 25 μl zmieszanych kulek do każdej studzienki, potrząsając butelką z koralikami z przerwami, aby uniknąć osiadania kulek. Ostateczna objętość powinna wynosić 75 μl w każdym dołku po dodaniu kulek.
- Uszczelnij płytkę za pomocą uszczelniacza do płyt. Owiń całą płytę, w tym odwróconą pokrywę talerza, folią aluminiową. Umieść płytkę na wytrząsarce do płytek, zabezpiecz ją i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Aby zapobiec wyciekom, nie należy wywierać nadciśnienia na uszczelniacz do płyt.
- Nie odwracając, umieść płytkę na kolektorze próżniowym, zastosuj próżnię jak poprzednio i dodaj 200 μl 1x buforu płuczącego do każdej studzienki.
- Usunąć zawartość studzienek na płytce testowej przez filtrację próżniową. Nadmiar buforu do mycia zetrzyj z dna talerza wkładką chłonną lub ręcznikami papierowymi. Powtórz ten krok jeszcze raz.
nuta: Jeśli test jest wykonywany przy użyciu mikropłytki z dnem w kształcie litery V lub mikroprobówek FACS, pomiń kroki 1.12 i 1.13. Zamiast tego odwirować płytkę o sile 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant za pomocą pipety wielokanałowej.
- Dodać 25 μl przeciwciał wykrywających (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki.
- Uszczelnij płytkę świeżym uszczelniaczem do płyt. Owiń całą płytę, w tym odwróconą pokrywę talerza, folią aluminiową.
- Umieścić płytkę na wytrząsarce do płytek i wstrząsać z prędkością około 500 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Bez odkurzania dodać 25 μl odczynnika streptawidyna-fikoerytryna (SA-PE) bezpośrednio do każdej studzienki. Rozcieńczanie odczynnika nie jest konieczne.
- Uszczelnij płytkę świeżym uszczelniaczem do płyt. Owiń całą płytę, w tym odwróconą pokrywę talerza, folią aluminiową.
- Umieść płytkę na wytrząsarce do płytek i potrząsaj z prędkością około 500 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Powtórz krok 1.13 powyżej.
- Dodaj 200 μl 1x buforu do płukania do każdej studzienki. Ponownie zawieś koraliki na wytrząsarce talerzy na 1 minutę.
- Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś próbki z płytki filtracyjnej do probówek FACS, aby odczytać próbki z cytometru przepływowego.
nuta: Objętość próbki można zwiększyć z 200 μl do 300 μl, dodając dodatkowe 100 μl 1x buforu płuczącego do każdej probówki, aby uniknąć wyschnięcia próbki. W razie potrzeby próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C, chronione przed światłem i analizowane następnego dnia. Jednak długotrwałe przechowywanie próbki może prowadzić do zmniejszenia sygnału.