Multipleksowy test immunologiczny oparty na kulkach do ilościowego określania wielu celów cytokin

Streszczenie

Źródło: Lehmann, J. S., et al. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje test immunologiczny oparty na multipleksie do ilościowego oznaczania wielu celów cytokin w próbce. Mieszanina odrębnych mikrosfer sprzężonych z przeciwciałami specyficznymi dla cytokin służy do wiązania cytokin obecnych w próbce. Reporterki znakowane streptawidyną są unieruchamiane na związanych cytokinach za pomocą biotynylowanych przeciwciał wykrywających. Cytometria przepływowa identyfikuje związane cytokiny na podstawie unikalnych rozmiarów i intensywności wewnętrznej fluorescencji mikrosfer, podczas gdy intensywność fluorescencji reporterów wskazuje liczbę cytokin.

Protokół

1. Przygotowanie próbki biologicznej

UWAGA: Wybrane miejsce anatomiczne i objętość pobrania krwi są pozostawione do uznania każdego badacza z osobna i nie będą miały wpływu na wynik testu. Jednak po ich uzyskaniu z próbkami należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.

1. Przygotowanie próbek surowicy
   1. Pobrać żądaną objętość krwi do preferowanej probówki do pobrania krwi i pozostawić ją do krzepnięcia przez co najmniej 30 minut.
   2. Odwirowywać próbkę przez 10 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej.
   3. Natychmiast usunąć surowicę i oznaczenie zawa....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wirówka Allegra 6R z adapterem nośnika MICROPLUS	Beckman Coulter	366816	W przypadku LEGENDplex testy przeprowadza się w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub U (opcjonalnie)
LEGENDplex Mouse T pomocnik Panel cytokin	Legenda biologiczna	740005	Multipleksowy test immunologiczny (13-plex)
Przeciwciało anty-mysie CD3ε	Legenda biologiczna	100314	Klon 145-2C11, niska endotoksyna, format wolny od azydku
Przeciwciało anty-mysie CD28	Legenda biologiczna	102112	Klon 37.51, niska endotoksyna, format wolny od azydku
Pompa próżniowa	EMD Milipore	WP6111560	Do testów LEGENDplex przy użyciu płytek filtracyjnych (zalecane)
Kolektor próżniowy	EMD Milipore	MSVMHTS00	Do testów LEGENDplex przy użyciu płytek filtracyjnych (zalecane)
Sterylne jednorazowe zbiorniki na odczynniki	Fisher Naukowy	07-200-130	Lub równoważny
Rurki polipropylenowe MicroFACS	Fisher Naukowy	Numer katalogowy 11-842-90	W przypadku LEGENDplex testy przeprowadza się w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub U (opcjonalnie)
Zestaw pipet	Fisher Naukowy	14-388-100	Cztery wielkości pipet (0,2-2 μL, 2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL)
Pipeta wielokanałowa	Fisher Naukowy	FA10011G	możliwość dozowania od 5 μL do 200 μL
Wytrząsarka do mikropłytek	Fisher Naukowy	88880023	Lub równoważny
Mikrowirówka	Fisher Naukowy	75002410	Lub równoważny
Rury FACS	Fisher Naukowy	NC9885747	12 x 75 mm okrągłe dno
PMA (12-mirystynian 13-octanu forbolu)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P8139
Lipopolisacharyd (LPS)	Sigma-Aldrich	L-8274	Escherichia coli O26:B6
Jonomycyna	Sigma-Aldrich	I0634
Myjka ultradźwiękowa Branson B200	Sigma-Aldrich	Z305359	Lub równoważny
Probówki do mikrowirówek	Sigma-Aldrich	Z666505	Probówki polipropylenowe 1,5 ml
Cytometr przepływowy	rozmaity	rozmaity	Cytometr wyposażony w pojedynczy laser (488nm niebieski) lub dwa lasery (488nm niebieski lub 532nm zielony + 633nm czerwony) zdolny do odczytu długości fal emisji przy 575nm i 660nm
96-dołkowa płyta polipropylenowa	Firma VWR	82050-662	W przypadku LEGENDplex testy przeprowadza się w mikroprobówkach, 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub U (opcjonalnie)

powiedział: powiedział: