$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Izolacja komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów związanych z nowotworem
- W kapturze z przepływem laminarnym usuń guzy od myszy poddanych eutanazji CO2 i umieść guzy w pożywce RPMI bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
nuta: Golenie myszy i spryskanie ich 70% etanolem przed usunięciem guzów jest wysoce zalecane, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenia sierści. Upewnij się, że guz nie przekracza 25 - 40 mm2 , ponieważ większe guzy mają mniej komórek dendrytycznych (DC), które są kruche i podatne na śmierć komórki. Jeśli potrzebna jest większa liczba DC, każdej myszy można wstrzyknąć komórki nowotworowe w wielu miejscach.
- Pod sterylnym kapturem laminarnym posiekaj guzy na małe kawałki (około 1 x 1 mm2) za pomocą nożyczek chirurgicznych.
- Dodaj wszystkie fragmenty guza z jednej myszy do sterylnej probówki o płaskim dnie o pojemności 30 ml z magnetycznymi mieszadłami zawierającymi 5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), 2 mg / ml kolagenazy IV i 0,01 mg / ml DNazy I.
ostrożność: Komórki szpikowe wytwarzają energię poprzez glikozylację, nawet w stanie stacjonarnym. Dlatego należy używać wyłącznie pożywek zawierających glukozę (np. HBSS, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)), ponieważ głód glukozy przez zaledwie 10-15 minut spowoduje śmierć komórek i apoptozę w ciągu 24 godzin. Używaj tylko kolagenazy o niskiej zawartości endotoksyn IV, ponieważ kolagenaza jest wytwarzana przez bakterie Gram-dodatnie (Clostridium histolyticum).
- Mieszać z prędkością około 200 - 400 obr./min w inkubatorze o temperaturze 37 oC z mieszadłem magnetycznym przez 20-30 min.
- Dodać 5 ml kompletnej pożywki i energicznie zawiesić.
- Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 μm. Wirować w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut, aby granulować komórki.
ostrożność: Nie próbuj izolować komórek bezpośrednio po trawieniu enzymatycznym, ponieważ niektóre nowotwory są martwicze i zawierają stosunkowo duże ilości szczątków komórkowych lub macierzy zewnątrzkomórkowej. Zastosuj komórki na podłożu o gradiencie gęstości 15%, aby uzyskać tylko komórki.
- Zawiesić 9 ml pożywki o gradiencie gęstości z 1 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu dostosowania osmolalności i uzyskania 100% roztworu podstawowego Percoll. Wymieszaj 1,5 ml pożywki o gradientzie gęstości z 8,5 ml HBSS i energicznie wymieszaj z osadem komórek nowotworowych. Delikatnie ułóż 2 ml DMEM na wierzchu pożywki o gradiencie gęstości 15% i odwiruj w temperaturze 400 rcf przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatanty, ponieważ komórki utworzą osad na dnie probówki.
- Umyj granulowane komórki dwukrotnie, ponownie zawieszając je w 10 ml HBSS zawierającym 2% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (bufor izolacyjny) i odwiruj w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5-10 minut w celu osadzenia komórek.
- Policz komórki na hemocytometrze za pomocą błękitu trypanowego pod mikroskopem świetlnym.
- Ponownie zawiesić 1 x 108 komórek w 1 ml buforze izolacyjnym i inkubować je w temperaturze 4 oC z 30 μl sprzężonych kulek magnetycznych CD11b+ przez 15 minut.
UWAGA: Unikaj stosowania kulek sprzężonych z CD11c, ponieważ spowoduje to aktywację prądu stałego i wywołanie śmierci komórki. Nie próbuj blokować FcγRII i FcγRIII za pomocą przeciwciał anty-CD16/32. Przeciwciała blokujące liminują FcγR, indukują silną fosforylację kinaz białkowych aktywowanych mitogenem (MAP) i przygotowują prąd stały.
- Usunąć nadmiar niezwiązanych kulek, dodając 9 ml buforu izolacyjnego i odwirować komórki w temperaturze 400 rcf przez 5-10 minut w temperaturze 4oC.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforze izolacyjnym. Umieść komórki na wstępnie umytej kolumnie magnetycznej. Przemyć kolumnę dwukrotnie 3 ml buforu izolacyjnego.
- Zdejmij kolumnę z magnesu. Odpipetować 6 ml buforu izolacyjnego na kolumnę i wypłukać magnetycznie znakowane komórki do sterylnej probówki zbiorczej, naciskając tłok. Odwirować komórki w temperaturze 400 rcf przez 5 - 10 minut w temperaturze 4 oC.
- Ponownie zawiesić komórki w ilości 100 μl na 1 x 107 komórek i wybarwić następującymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem: Linage ujemne (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI i Ly6G), MHCII, Ly-6C.
- Sortuj komórki, bramkując małe komórki, używając rozpraszania bocznego (SSC) i rozpraszania do przodu (FSC), a następnie hoduj w kompletnym pożywce uzupełnionej 5 ng / mL GM-CSF - Inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 oC, aby umożliwić makrofagom przyleganie do płytki. Następnie przenieś luźne i nieprzylegające komórki do nowego naczynia hodowlanego.
nuta: Mysz MoDC są zdefiniowane jako CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/int. Ekspresja Ly6C może się znacznie różnić między modelami guza, a w niektórych modelach (np. LMP) MoDC całkowicie nie mają ekspresji Ly6C. Jeden 100 mm3 B16F10 guz zwykle zawiera 5 x 104 DC, co daje około 4 - 5 x 106 całkowitych komórek. Spośród tych komórek 10 - 15% to komórki odpornościowe, a 8 - 10% to MoDC. Zwiększenie liczby DC można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie myszom guzów w wielu miejscach. Sortuj tylko małe komórki SSC/FCS, ponieważ inne komórki szpiku mogą wyrażać markery, takie jak CD11c i Ly6C.
fakultatywny: Posortuj monocyty naciekające nowotwór jako małe komórki SSC / FSC, które wyrażają Ly6Chi i są ujemne dla MHCII. Następnie hoduj monocyty in vitro z 50 ng / mL GM-CSF w celu uzyskania DC.
2. Przygotowanie kompleksów immunologicznych Gumor-IgG
- Hodowla komórek nowotworowych w kolbie hodowlanej o średnicy 75 cm2 do 70% konfluencji w kompletnych pożywkach DMEM.
- Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny/EDTA, aby odłączyć komórki od kolby hodowlanej i monitorować morfologię komórek pod mikroskopem świetlnym, aby uniknąć nadmiernej trypsynizacji.
- Dodać 8 ml kompletnej pożywki hodowlanej (na 2 ml trypsyny), aby zahamować trawienie trypsyny, i odwirować w temperaturze 4 oC, 400 rcf przez 5-10 minut, aby osadzać komórki.
nuta: Sprawdź komórki nowotworowe pod kątem Mycoplasmy za pomocą komercyjnego zestawu do PCR. Test na obecność bakterii Gram-ujemnych i endotoksyn grzybiczych przy użyciu testu Limulus Amebocyte Lysate (LAL)). Surowica musi zostać przefiltrowana przez 0,22 μM i przetestowana na obecność wirusów 9 Kodeksu Przepisów Federalnych. Dodatkowo przetestuj pożywkę hodowlaną i surowice, upuszczając 100 - 200 μl na agar LB lub bulion i hoduj przez 2 dni w temperaturze 37 oC.
- Ponownie umyj komórki z trypsyny i resztek surowicy, ponownie zawieszając je w 10 ml PBS i odwiruj w temperaturze 400 rcf przez 5 - 10 minut. Odessać supernatant i powtórzyć płukanie jeszcze 2 razy.
- Utrwal komórki w 1,8% buforowanym paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyć komórki, ponownie zawieszając je w 10 ml PBS i odwirować w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut.
- Odessać supernatanty i powtórzyć pranie jeszcze dwa razy.
fakultatywny: W przypadku testów wychwytu nowotworu komórki można znakować, inkubując je przez 5 minut w temperaturze 37 oC w PBS zawierającym 1 μM ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE). CFSE jest następnie hartowany z kompletnymi mediami przez 10 minut w lodzie. Komórki należy dokładnie przemyć w PBS zawierającym 2% surowicy w celu usunięcia resztek barwnika.
- Ponownie zawiesić komórki w buforze sortowania komórek aktywowanym fluorescencją (FACS) (PBS uzupełniony 2% FCS + 5 mM EDTA) i 0,5 μg/ml anty-CD16/32 w celu zablokowania potencjalnych niespecyficznych interakcji białko-białko. Płytka w kształcie litery U, 96 dołków/płytka, o stężeniu 1 x 10,5 komórek na 100 μl.
- Dodać różne rozcieńczenia przeciwciał wiążących nowotwór w zakresie od 5 μg do 5 ng / 1 x 105 komórek. Inkubować płytkę na lodzie przez 15-20 min.
nuta: Przeciwciała IgG wyizolowano z surowicy naiwnych samic myszy w wieku 20-24 tygodni na kolumnach białka A, zgodnie z opisem.
- Przemyć komórki, dodając 150 μl PBS i odwirowując płytkę w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut.
- Wyrzuć supernatanty i powtórz pranie dwukrotnie. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforze FACS zawierającym przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem. Inkubować płytkę na lodzie przez 20 minut.
- Przemyć komórki, dodając 200 μl buforu FACS i odwirowując płytkę w temperaturze 400 rcf przez 5 - 10 minut. Odrzucić supernatanty i powtórzyć mycie.
- Przeanalizuj wiązanie guza za pomocą cytometrii przepływowej i określ minimalne stężenie wymagane do pokrycia komórek.
nuta: Przeciwciała, które nie zwiększają średniej intensywności fluorescencji (MFI) barwionych komórek nowotworowych co najmniej pięciokrotnie w stosunku do kontroli izotypowej, nie powinny być stosowane w kolejnych testach funkcjonalnych.
3. Aktywacja MoDC za pomocą układu scalonego Gumor-IgG
- Pokrywać komórki nowotworowe minimalnym stężeniem IgG, jak opisano w punktach od 2.1 do 2.4.3
- Na dzień przed aktywacją MoDC za pomocą układu scalonego guza, zastąp pożywkę hodowlaną MoDC zawierającą GM-CSF. W tym celu należy delikatnie zassać pożywkę i raz umyć komórki wstępnie podgrzaną, kompletną pożywką hodowlaną.
nuta: Izolowane dojrzałe MoDC związane z nowotworem powinny być hodowane przez co najmniej 2 - 3 godziny (lub nawet przez noc) po sortowaniu w kompletnych pożywkach bez GM-CSF, a przed aktywacją ich za pomocą IC.
- W przypadku analiz wychwytu nowotworu dodaj IC guza znakowany CFSE do MoDC w stosunku 1:5 (IC: MoDC) i inkubuj przez noc przez 12 - 16 godzin w 1 ml kompletnej pożywki na 1 x 106 DC.
- W przypadku analiz FACS eksperymentów aktywacji MoDC, dodaj tumor-IC w stosunku 1:1 (IC: MoDC) i inkubuj przez noc przez 12 - 16 h.
nuta: Zdecydowanie zaleca się włączenie studzienki kontroli pozytywnej, w której MoDC jest stymulowany 1 μg/ml LPS lub innych agonistów TLR.
- Po aktywacji przez noc odessać supernatanty i delikatnie przemyć komórki trzykrotnie buforem izolacyjnym lub 10 mM EDTA HBSS.
- Aby oderwać prąd stały od płytki, należy inkubować komórki przez 2 - 3 minuty w 1 ml HBSS zawierającym 10 mM EDTA i odłączyć komórki przez energiczne pipetowanie.
- Odwiruj komórki przy 400 rcf i ponownie zawiesij 1 x 106 DC w 90 μl PBS uzupełnionym 2% FCS, 5 mM EDTA (bufor FACS) i 0,5 μg przeciwciał blokujących. Inkubować na lodzie przez 5 - 10 minut.
- Dodać 10 μl mieszaniny przeciwciał barwiących do komórek i inkubować na lodzie przez 15 minut.
- Dodać 2 ml buforu FACS do komórek i odwirować w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut.
- Ponownie zawieś ogniwa w buforze FACS o pojemności 200 μl.
- Dodać 0,5 - 1 μg/ml DAPI 1 - 2 minuty przed uruchomieniem próbek, aby wykluczyć martwe komórki z analiz. Nie należy nadmiernie inkubować DAPI, ponieważ MoDC podejmie go w ciągu 10 - 15 minut.