Wykrywanie nieprawidłowych białek prionowych w tkance mózgowej za pomocą immunohistochemii

Abstract

Źródło: Orge, L., et al. Wykrywanie nieprawidłowego białka prionowego za pomocą immunohistochemii. J. Vis. Exp. (2023).

Ten film demonstruje technikę wykrywania nieprawidłowo sfałdowanego białka prionowego w sekcjach mózgu za pomocą immunohistochemii. Po potraktowaniu części mózgu kwasem mrówkowym w celu denaturacji prionów i zminimalizowania ryzyka infekcji, a także po zdemaskowaniu agregatów prionowych za pomocą indukowanego ciepłem odzyskiwania epitopów, skrawki są znakowane immunologicznie pod kątem nieprawidłowo sfałdowanych agregatów białka prionowego i obserwowane pod mikroskopem.

Protocol

1. Cięcie tkanek i przygotowanie preparatu

1. Wyciąć odcinki tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) o grubości 3-5 μm za pomocą mikrotomu.
2. Spływać sekcje na oczyszczoną wodę o temperaturze około 10 °C niższej od temperatury topnienia użytej parafiny. Podnieś skrawki z wody na specjalnie przygotowane szkiełka mikroskopowe (patrz Tabela materiałów). Poczekaj, aż woda dokładnie spłynie ze szkiełek.
3. Szkiełka należy inkubować przez noc w temperaturze 50 °C, aby zwiększyć przyczepność szkiełek do szkiełek.
   nuta: Zaleca się przygotowanie świeżo wyciętych tkanek do protokołów IHC, chociaż skrawki kontroli dodatniej i ujemnej TSE można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać. Kroki od 2 do 4 należy wykonać w dygestorium chemicznym.

2. Deparafinizacja i ponowne nawodnienie

1. Umieść szkiełka z skrawkami tkanek w koszu do barwienia ze stali nierdzewnej (patrz Tabela materiałów). Zanurz kosz w kąpieli ksylenowej (pojemnik do barwienia ze stali nierdzewnej) na 3 minuty, wyjmij i ponownie zanurz.
2. Usuń skrawki ksylenu i ponownie nawodnij, zanurzając je w absolutnej kąpieli etanolowej na 3 minuty. Wyjmij i zanurz ponownie.
3. Wysuszyć skrawki na powietrzu i umieścić w kąpieli z 90% etanolem na 1 minutę. Przenieść do kąpieli w 70% etanolowej na kolejną minutę, a następnie ostatecznie przenieść do kąpieli w 50% etanolowej na 1 minutę. Przy każdym zabiegu kąpieli etanolowej delikatnie dwukrotnie porusz kosz szkiełkowy i opróżnij kosz przed następnym przeniesieniem.

3. Pobieranie epitopów

1. Ostrożnie zanurz skrawki tkanki w 98% kwasie mrówkowym w temperaturze pokojowej na 30 minut. Opłucz skrawki w wodzie z kranu przez 5 minut, a następnie dwukrotnie spłucz w wodzie destylowanej.
   ostrożność: Kwas mrówkowy jest silnie. Należy nosić okulary ochronne i rękawice.
2. Wykonaj pobieranie antygenu wywołanego ciepłem (HIER), wykonując poniższe czynności.
   nuta: Ten etap przeprowadza się przez uwodnione autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 30 minut w określonej komorze ciśnieniowej (patrz tabela materiałów).
   1. Podgrzewać bufor cytrynianowy (10 mM, pH 6,1, patrz tabela materiałów) w temperaturze 98 °C przez około 20 minut w pojemniku do barwienia ze stali nierdzewnej umieszczonym w komorze ciśnieniowej wypełnionej 500 ml wody destylowanej.
      nuta: W niniejszym badaniu nastawa programu wynosiła 1 (SP1) dla konkretnego używanego sprzętu.
   2. Gdy alarm wskaże, że urządzenie osiągnęło zaprogramowany czas i temperaturę, zanurz kosz ze szkiełkami i rozpocznij program do Nastawy 2 (121° C na 30 min). W celu kontroli jakości umieść na koszu odcinek samoprzylepnej taśmy wskaźnikowej autoklawu, aby monitorować temperaturę i ciśnienie oraz rejestrować ciśnienie początkowe i końcowe tego programu.
   3. Jeśli liczba szkiełek do barwienia immunologicznego nie osiąga pojemności kosza, użyj czystych, pustych szkiełek, aby zająć puste miejsca. Po zakończeniu programu należy odczekać pasywny powrót komory do ciśnienia otoczenia (co najmniej 30 min).
      nuta: Dłuższy czas trwania może zmniejszyć niespecyficzne barwienie tła.
   4. Ostrożnie przenieś kosz przesuwny do pojemnika na plamy ze stali nierdzewnej wypełnionego wodą destylowaną na 5 minut.

4. Inaktywacja endogennej peroksydazy

1. Zanurzyć kosz szkiełkowy zawierający skrawki próbki w kąpieli z 3% nadtlenkiem wodoru (_H2O2) w metanolu na 30 minut. Opłukać sekcje pod bieżącą wodą (5 min). Odcedź i zanurz sekcje w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) na dodatkowe 5 minut.

5. Immunodetekcja

UWAGA: W niniejszym badaniu, immunodetekcja została przeprowadzona przy użyciu formatu szczeliny kapilarnej przy użyciu dostępnego na rynku systemu montażu klipsów do slajdów (patrz Tabela Materiałów). Stosowane są również inne systemy szkiełek immunohistochemicznych.

1. Umieścić każde szkiełko na dostępnym w handlu uchwycie na pokrywie (patrz tabela materiałów) uprzednio zwilżonym TBS, unikając pęcherzyków, stroną z chusteczką skierowaną w stronę uchwytu i krawędziami szkiełka pokrywającymi się z dwoma dolnymi punktami uchwytu.
   1. Przytrzymaj zespół uchwytu szkiełka między kciukiem a palcem wskazującym, jednym palcem na górze sample szkiełka, a drugim na spodzie uchwytu. Następnie umieść zespół w galerii systemu.
   2. Aby upewnić się, że zestaw jest dobrze zmontowany, napełnij studzienkę między szkiełkiem do próbek a uchwytem TBS, który nie może natychmiast się przelać. Od tego momentu należy upewnić się, że około 80 μl TBS musi być zachowane między uchwytem a szkiełkiem. Nie dopuścić do wyschnięcia sekcji.
2. Po wejściu do systemu, w celu zmniejszenia barwienia tła przed podaniem działaniu przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciało przeciwko białkom prionowym (anty-PrP), patrz tabela materiałów), należy wstępnie inkubować szkiełka z próbką z 20% normalną surowicą tego samego gatunku, co drugorzędowe przeciwciało gospodarza używane do barwienia immunologicznego (w tym przypadku surowica końska) przez 30 minut w TBS.
3. Rozmrozić liczbę podwielokrotności przeciwciała, które należy zastosować, w zależności od analizowanego gatunku zwierzęcia, liczby odcinków próbki do zbadania oraz ilości roboczego rozcieńczenia.
   nuta: Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj 10% normalnej surowicy tego samego gatunku, co źródło roztworów przeciwciał drugorzędowych i pierwszorzędowych. Jeśli to możliwe, aby uzyskać najlepsze wyniki, źródłem normalnej surowicy i przeciwciał drugorzędowych powinien być gospodarz tego samego gatunku.
4. Nie myjąc skrawków, nanieść roztwór przeciwciała pierwszorzędowego bezpośrednio (200 μl) do każdej studzienki zestawu szkiełek i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
5. Do umycia napełnij dołki zestawów uchwytów do szkiełek TBS i odczekaj 5 minut. Powtórz dwukrotnie.
6. Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało drugorzędowe (monoklonalne przeciwciało antymysie Horse Ab, patrz tabela materiałów) w stosunku 1/200 w TBS 10% surowicą końską. Przygotuj wymaganą objętość w zależności od liczby sekcji, które mają być poddane zabiegowi.
7. Nałożyć roztwór przeciwciał drugorzędowych (200 μl) do każdej studzienki z zestawu szkiełek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Umyć zgodnie z opisem w kroku 5.5.
9. Do inkubacji z peroksydazą kompleksu awidyna-biotyna (kompleks ABC/HRP, patrz tabela materiałów), należy przygotować odczynnik 30 minut przed użyciem. Nałożyć złożony roztwór ABC/HRP (200 μl) do każdego dołka z zestawu uchwytów na płytki ślizgowe. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
10. Umyć zgodnie z opisem w kroku 5.5.

6. Rozwój z chromegenem 3,3' diaminobenzydyny (DAB)

UWAGA: DAB jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. W związku z tym podczas pracy z tym odczynnikiem należy zachować odpowiednią ostrożność, w tym ochronę oczu, fartuchy laboratoryjne, rękawice i dobre procedury laboratoryjne. Utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami.

1. Rozcieńczyć chromogen zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela materiałów) bezpośrednio przed użyciem. Nanieść roztwór chromogenu (400 μl) na każdą studzienkę zestawu płytek szkiełkowych.
2. Inkubować do 30 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku dodatnich odcinków PrP^Sc (nieprawidłowa izoforma białek prionowych) 10-minutowy okres inkubacji jest zwykle wystarczający
.
3. Usunąć pozostały roztwór chromogenu, myjąc szkiełka w wodzie destylowanej. Wyjmij szkiełka z uchwytów pokrywy i umieść je w plastikowym pojemniku z wodą destylowaną.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkohol etylowy	Laboratorium	LB0507-9010	Nierozcieńczony
			Rozcieńczony 90%, 70% i 50% w wodzie destylowanej
Kompleks awidyna-biotyna i peroksydaza Zestaw Vectatain Elite ABC Peroksydaza	Laboratoria wektorowe	PK-6100	Przygotuj i delikatnie wymieszaj 30 minut przed użyciem zgodnie z instrukcją zestawu. Nie mieszać po odstawieniu.
Biotynylowane przeciwciało drugorzędowe (IgG H + L przeciwko mysi koni)	Laboratoria wektorowe	BA-2000-1.5	Rozcieńczyć w stosunku 1/200 w TBS z 10% normalną surowicą końską. Przygotuj wymaganą objętość w zależności od liczby sekcji.
Chromogen Diaminobenzydyna-DAB, zestaw substratów, Peroksydaza	Laboratoria wektorowe	Zobacz materiał SK-4100	Przygotować przed użyciem zgodnie z instrukcją zestawu. Użyć 400 μl roztworu na sekcję.
Komora ciśnieniowa DakoCytomation Pascal	DAKO	S2800
Hematoksylina Ehrlicha:
Alkohol etylowy	Laboratorium	LB0507-9010
Lodowaty kwas octowy	Merck	Numer katalogowy: 101830
Ałun potasowy	Merck	1.01047.1000
gliceryna	Merck	1.04091.1000
Endogenny roztwór blokowy peroksydazy (stężenie 3%H2O2):			40 ml nadtlenku wodoru (30% w/w) w 360 ml metanolu. Przygotuj się przed użyciem
Nadtlenek wodoru (30% w/w)	Scharlau	HI0136
metanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Kwas mrówkowy 98%	Merck	Numer katalogowy: 1.00264.1000	Nierozcieńczony
Mikrotom	Shandon-AS325	Mikrotom	Shandon-AS325
Normalny roztwór blokowy surowicy (20%) w TBS: Surowica normalna konia	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 16050-122	Przygotować objętość końcową zgodnie z liczbą skrawków w teście (200 μl roztworu na sekcję).
Pierwszorzędowe przeciwciało anty-PrP Mysz MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Owce, w tym trzęsawka atypowa, jeleniowate, kotowate. Nie nadaje się do bydła. W zależności od liczby skrawków w teście (200 μl roztworu na sekcję) i rozcieńczenia przeciwciał, przygotować końcową objętość w TBS uzupełnioną 10% normalnej surowicy z gatunku, w którym wyhodowano przeciwciało drugorzędowe (normalna surowica konia) Zwykłe rozcieńczenie przeciwciał: MAb 2G11 1/100, ale rozcieńczenie robocze powinno być ustalone w każdej nowej partii, aby uzyskać stężenie pozwalające uzyskać najsilniejsze oznakowanie z najniższym tłem. W celu przechowywania należy zamrozić podwielokrotne objętości co najmniej 10 μl do sterylnych mikroprobówek. Rozmrażać i używać po jednej porcji na raz.
Pierwszorzędowe przeciwciało anty-PrP Mysz MAb 12F10	Firma chemiczna Kajmanów	Numer katalogowy: 189710	PrP142-160 Bydło, nie nadaje się dla owiec Zwykłe rozcieńczenie przeciwciał: 1/200, ale należy również ustalić rozcieńczenie robocze. Przygotuj się jako MAb 2G11
Komora Shandon CoverplateTM	Thermo Scientific	72110017
Centrum szczepień Shandon Sequenza®	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Stojak na slajdy do barwienia	Thermo Scientific	73310017
Bufor cytrynianowy roztworu (10 mM pH 6,1):			2,55 g dwuwodnego cytrynianu trójsodowego i 0,255 g kwasu cytrynowego w jednym litrze oczyszczonej wody. Dostosować pH roztworu roboczego do 6,1 za pomocą 10 mM roztworu kwasu cytrynowego (1,05 g kwasu cytrynowego w 500 ml oczyszczonej wody) Przygotuj się w dniu testu.
Cytrynian trisodowy dwuwodny	Sigma-aldrich	S4641-500G
Kwas cytrynowy	Sigma Aldrich	Zobacz materiał C0759
Słoik do barwienia i kosz	Deltalab (Laboratorium Deltalab)	Rok 19360
		Rok 19361
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus	Firma VWR	Nr kat. 631-0108
Roztwór soli fizjologicznej buforowany trisem (TBS) (50 mM ZASADA TRIZMA; 0,8% NaCI; pH 7,6):			10xTBS (roztwór podstawowy 0,5 M ZASADY TRIZMA; 8% NaCI; pH 7,6): TRIZMA BASE 60,57 g i NaCl 80 g w 800 ml oczyszczonej wody. Dostosować pH roztworu podstawowego za pomocą kwasu solnego 37% i końcowej objętości do jednego litra oczyszczoną wodą (przechowywać w temperaturze 5± 3 °C do 2 miesięcy) Rozcieńczyć roztwór podstawowy TBS w stosunku 1:10 w dniu oznaczania.
BAZA TRIZMA	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Chlorek sodu (NaCl)	Merck	106404
ksylen	Odczynniki Panreac Applied Chem ITW	251769	Nierozcieńczony