1. Przygotowanie immunogenów
- Hodować każdy szczep sinic w odpowiednim pożywce hodowlanej w warunkach opisanych w tabeli 1.
UWAGA: Pożywka wzrostowa i warunki hodowli dla każdego szczepu sinic są wymienione w Tabeli 1. Wszystkie szczepy sinic, z wyjątkiem K17, należą do grupy Antonio Quesady z Uniwersytetu Autonoma (Madryt, Hiszpania). Przeciwciało przeciwko Planktothrix rubescens uzyskano z naturalnej próbki monospecyficznego zakwitu tej sinicy ze zbiornika Vilasouto (północna Hiszpania).
- Określ ilościowo liczbę komórek za pomocą komory do liczenia komórek za pomocą mikroskopii optycznej, aby uzyskać około10-8 komórek/ml z hodowli w późnej wykładniczej lub stacjonarnej fazie wzrostu.
- Zebrać komórki z 5 ml kultury przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 5 minut.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w probówce o pojemności 10 ml z 5 ml soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (1x PBS), aby uzyskać około 10-8 komórek/ml.
- Homogenizować i lizować komórki zawiesiny za pomocą sonikacji przez 5 cykli, z 30 s każdy, z 30-60-sekundową przerwą na lodzie, przy użyciu przenośnego, ręcznego procesora ultradźwiękowego lub zanurzając rurkę w łaźni wodnej rozdrabniacza komórek przy maksymalnej amplitudzie (30 kHz).
- Powtórz kroki 1,3 - 1,5 dla każdego szczepu cyjanobakterii.
UWAGA: Sonikacja powoduje rozerwanie komórek i uwolnienie zawartości komórkowej. Podczas gdy białka i polisacharydy są dobrymi immunogenami, określone cząsteczki, takie jak lipidy i kwasy nukleinowe, same w sobie nie wywołują humoralnej odpowiedzi immunogennej. Dlatego muszą wiązać się z nośnikami, takimi jak polisacharydy lub białka, aby zwiększyć złożoność molekularną. Ponadto sonikacja uwalnia materiał wewnątrzkomórkowy, który może wywołać produkcję przeciwciał.
2. Produkcja przeciwciał poliklonalnych
- Przygotować pierwszą dawkę immunogenu przez zmieszanie 0,5 ml ultradźwiękowego lizatu komórkowego otrzymanego w kroku 1.5 z 0,5 ml kompletnego adiuwantu Freunda. Dostarczyć go do operatora zakładu hodowli zwierząt w celu produkcji poliklonalnych przeciwciał króliczych.
- Przygotować trzy kolejne dawki, tak jak poprzednio, do dalszego użycia w celu poprawy pamięci w procesie produkcji przeciwciał, mieszając 0,5 ml tego samego homogenatu/lizatu otrzymanego w kroku 1,5 z 0,5 ml niekompletnego adiuwantu Freunda. Przekaż je do zakładu zwierzęcego, aby przeprowadzić proces produkcji przeciwciał.
- Powtórzyć kroki 2.1 i 2.2 dla każdego nowego procesu produkcji przeciwciał.
UWAGA: Zazwyczaj produkcja przeciwciał jest powierzana wyspecjalizowanym zakładom lub firmom zajmującym się zwierzętami, ponieważ do pracy ze zwierzętami wymagane są odpowiednie licencje i szkolenie. Firmy dostarczają względny test immunoenzymatyczny (ELISA) mierzący ilość przeciwciał specyficznych dla antygenu obecnych w próbce surowicy.
3. Oczyszczanie przeciwciał
- Oczyść frakcję immunoglobuliny G (IgG) zarówno z surowicy immunologicznej, jak i przedimmunologicznej zebranej w kroku 2 za pomocą chromatografii powinowactwa białka-A. Niektóre komercyjne zestawy do oczyszczania, oparte na systemach wkładów, działają dobrze; Postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy.
- Jeżeli zestaw do oczyszczania nie zapewnia systemu odsalania, należy zmienić bufor po wymyciu oczyszczonych przeciwciał do 0,1x PBS, albo przez dializę, albo przez użycie odśrodkowych urządzeń filtrujących o wielkości porów membrany 100 kDa (lub niższej).
- Oznaczyć stężenie przeciwciał, mierząc absorbancję przy 280 nm lub stosując metody kolorymetryczne, takie jak kwas Bradforda, Lowry'ego lub kwas bicinchoninowy (BCA).
UWAGA: Ważne jest, aby unikać włączania grup aminowych do buforu elucyjnego (np. Tris), ponieważ konkurują one z przeciwciałem o wiązanie się z powierzchniami stałymi aktywowanymi grupami epoksydowymi. Po oczyszczeniu ważne jest, aby zbadać aktywność przeciwciał za pomocą testu ELISA.
4. Znakowanie przeciwciał fluorescencyjnych
- Oczyszczone przeciwciała otrzymane w sekcji 3 oznaczyć fluorochromem (np. barwnikiem fluorescencyjnym dalekiej czerwieni) poprzez rozpuszczenie dostępnej w handlu fiolki zawierającej barwnik do znakowania 1 mg białka w 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO). Dodać 2 μl rozpuszczonego barwnika do każdego preparatu przeciwciała w stężeniu 2 mg/ml w końcowej objętości 50 μl w 50 mM roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (pH 8,5).
- Reakcje etykietowania należy utrzymywać w ciągłym mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia i 1 200 obr./min na platformie wibracyjnej.
- Oczyścić znakowane przeciwciała za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość (np. przy użyciu żelu o zakresie frakcjonowania od 1,5 do 30 kDa uwięzionego w kolumnie), zgodnie z zaleceniami dostawcy.
- Zmierzyć absorbancję przy 280 nm i przy 650 nm w eluatach i obliczyć skuteczność etykietowania zgodnie z zaleceniami dostawcy.
UWAGA: Do 50 x 50 μL reakcji znakowania przeciwciał można przeprowadzić za pomocą jednej fiolki barwnika fluorescencyjnego do znakowania 1 mg białka. Zaleca się przykrycie probówek folią aluminiową lub, alternatywnie, użycie nieprzezroczystych probówek o pojemności 0,5 ml, aby uniknąć procesów hartowania po kroku 4.3. W przypadku przeciwciał IgG optymalne znakowanie uzyskuje się przy 3-7 molach barwnika na mol przeciwciała.
5. Produkcja CYANOCHIP
- Przeciwciała i kontrole w roztworze do drukowania
- Przygotuj 30 μl każdego oczyszczonego przeciwciała w roztworze drukującym, mieszając każde przeciwciało w stężeniu 1 mg / ml w komercyjnym buforze do drukowania 1x białka z 0,01% (v/v) Tween 20 (detergent niejonowy), wszystkie jako stężenia końcowe.
UWAGA: Alternatywnie, roztwór przeciwciała może zawierać 20% glicerolu, 1% (w/v) sacharozy (lub trehalozy, jako środka konserwującego) i 0,01% (v/v) Tween 20 w buforze węglanowym (pH 8,5).
- Przygotuj 30 μl roztworu do drukowania jako kontrole: (a) 1x białkowy bufor drukujący z 0,01% (v/v) Tween 20, (b) białko-A oczyszczona surowica przedimmunologiczna o stężeniu 1 mg / ml w 1x białkowy bufor drukujący z 0,01% (v/v) Tween 20, i (c) albumina surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 1 mg / ml w 1x bufor do drukowania białka z 0,01% (v/v) Tween 20.
- Przygotować 30 μl znakowanej fluorescencyjnie, oczyszczonej surowicy przedimmunologicznej o różnych stężeniach (np. od 50 μg/ml do 1 μg/ml) w 1x buforze do drukowania białek za pomocą Tween 20, jak w kroku 5.1.1. Próbki te zostaną wykorzystane jako markery ramki fluorescencyjnej oraz do względnej kwantyfikacji fluorescencji po wykryciu.
- Dodać 30 μl roztworów drukarskich przygotowanych w krokach 5.1.1, 5.1.2 i 5.1.3 do najwyższej jakości 384-dołkowych mikropłytek do produkcji mikromatryc, takich jak polipropylen.
UWAGA: Bufor do drukowania białek zwiększa jakość i stabilność przeciwciał, a Tween 20 homogenizuje morfologię plamki i buduje sprzężenie białek. Zaleca się utrzymywanie mikropłytki 384-dołkowej w temperaturze 4 °C przed użyciem. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas. Polipropylen ma niską zawartość DNA, białka, ekstraktu komórkowego i wewnętrznego wiązania małych cząsteczek.
- Drukowanie przeciwciał na szkiełku mikroskopowym
UWAGA: Wydrukuj przeciwciała na aktywowanych szkiełkach mikroskopowych przy użyciu różnych platform matrycowych, takich jak urządzenia kontaktowe, z dzieloną igłą lub bezdotykowe, takie jak drukarki piezoelektryczne lub technologie "atramentowe". W tej pracy CYANOCHIP został rutynowo wydrukowany kontaktowo przy użyciu systemu robotycznego (macierzy) zdolnego do wykrywania ilości nL przeciwciał w skali μm.
- Ustaw warunki środowiskowe w drukarni na 20 °C i 40 - 50% wilgotności względnej.
- Ustaw podłoża szkiełek (np. szkiełka mikroskopowe aktywowane żywicą epoksydową o wymiarach 75 x 25 mm), aby wykonać kilka identycznych matryc przeciwciał na każdym szkiełku.
- Każde oczyszczone przeciwciało, łącznie z kontrolami i układem odniesienia, należy umieścić w potrójnym układzie plamki; w tych warunkach plamki mają średnicę 180 - 200 μm.
- Po wydrukowaniu należy pozostawić szkiełka na co najmniej 30 minut w temperaturze otoczenia, aby mogły wyschnąć, a następnie przechowywać je w temperaturze 4 °C; do pracy w terenie preparaty można transportować i przechowywać w temperaturze otoczenia przez kilka miesięcy.
UWAGA: CYANOCHIP jest drukowany w formacie potrójnej mikromacierzy punktowej z 3 x 8 identycznymi mikromatrycami na szkiełko lub 9 identycznymi tablicami w formacie mikromacierzy 1 x 9. Każdy rozmiar matrycy nie może być większy niż wymiary komory reakcyjnej dla uszczelki 24-dołkowej (zwykle 7,5 x 6,5 mm w komorze hybrydyzacyjnej 3 x 8).
- Przed użyciem mikromacierzy do analizy próbek środowiskowych należy użyć fluorescencyjnego testu immunologicznego z mikromacierzą warstwową (FSMI), aby określić robocze rozcieńczenie dla każdego przeciwciała w krzywej miareczkowania. Dla każdego przeciwciała należy użyć standardowego stężenia odpowiedniego immunogenu (103 - 104 komórek/ml) i seryjnych rozcieńczeń przeciwciała fluorescencyjnego (od 1:500 do 1:32 000). Optymalne stężenie przeciwciał odpowiada 50% maksymalnego natężenia sygnału uzyskanego w krzywej miareczkowania. Należy również określić czułość i swoistość dla każdego przeciwciała, jak opisano w Blanco i wsp.
6. Przygotowanie środowiskowych ekstraktów multianalitowych do testu immunologicznego FSMI (Fluorescencyjnego Sandwich Microarray Immunoastest)
- Ekstrakt multianalitowy z próbki cieczy
- Pobrać 1 - 100 ml płynnej próbki za pomocą sterylnej strzykawki (np. woda z brzegu zbiornika wodnego); ilość próbki zależy w dużym stopniu od potencjalnego stężenia celów.
- Zagęścić komórki, przepuszczając próbkę wody przez filtr poliwęglanowy o wielkości porów 3 μm i średnicy 47 mm; stężenie komórkowe między 103 - 108 komórek / ml jest pożądane dla pozytywnego wykrywania, ale rzeczywiste stężenie jest nieznane.
- Odzyskaj biomasę zebraną w filtrze za pomocą 1 ml zmodyfikowanego buforu soli fizjologicznej buforowanego Tris, buforu wzmocnionego Tween 20 (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl i 0,1% Tween 20), zeskrobując ją szpatułką do probówki o pojemności 15 ml.
- Homogenizować i dezagregować za pomocą ręcznego procesora ultradźwiękowego, jak opisano w kroku 1.5, lub po prostu przez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół; w ten sposób przygotowuje się próbkę do analizy za pomocą mikromacierzy.
- Ekstrakt multianalitowy z próbki stałej
- Odważyć do 0,5 g próbki stałej (np. skały, gleby lub osadów) do probówki o pojemności 10 ml i dodać do 2 ml TBSTRR.
- Sonikację należy przeprowadzić poprzez zanurzenie sondy sonikatora w probówce, zanurzenie rurki w łaźni wodnej silnego rogu sonikołatora lub za pomocą ręcznego sonikatora. Wykonaj co najmniej 5 cykli po 30 sekund przy 30 kHz, zatrzymując się na 30 s na lodzie.
- Filtr do usuwania piasku, gliny i innych gruboziarnistych materiałów za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml połączonej z nylonowym uchwytem filtra o średnicy od 10 do 12 mm i porach od 5 do 20 μm. Przepchnij próbkę przez filtr do probówki o pojemności 1,5 ml. Jeśli filtr się nasyci, wymieszać zawiesinę w strzykawce i przenieść ją do nowej; W ten sposób przygotowuje się materiał filtracyjny do testu immunologicznego (etap 7).
UWAGA: Pojemność buforowa TBSTRR zależy od rodzaju próbki. Ważne jest, aby przeprowadzić test immunologiczny natychmiast po przygotowaniu ekstraktu środowiskowego, aby uniknąć wpływu degradacji enzymatycznej na anality. Alternatywnie, dodać inhibitory proteazy do ekstraktu środowiskowego i zamrozić w temperaturze -80 °C do następnego etapu.
7. Test immunologiczny fluorescencyjnego mikromacierzy kanapkowej (FSMI)
- Blokowanie CYANOCHIP
UWAGA: Bezpośrednio przed użyciem należy potraktować wydrukowane preparaty w celu zablokowania wszystkich wolnych grup epoksydowych na szkiełku i usunięcia nadmiaru niekowalencyjnie związanych przeciwciał.
- Zanurzyć mikromacierz w 0,5 M Tris-HCl (pH 9) z 5% (w/v) roztworem BSA na czystej powierzchni (np. szalce Petriego lub probówce 50 ml) z łagodnym mieszaniem z platformy kołyskowej na 5 minut. Alternatywnie, połóż szkiełko na kropli od 100 do 200 μl powyższego roztworu tak, aby plamki mikromacierzy były skierowane do niego. Pozostaw na 3 - 5 minut, a następnie kontynuuj.
- Ostrożnie podnieś szkiełko za pomocą kleszczyków z plastikową końcówką; staraj się unikać dotykania stref mikromacierzy. Wyeliminuj nadmiar płynu, delikatnie uderzając szkiełkiem o ręcznik papierowy. Zanurz go w 0,5 M Tris-HCl (pH 8) z 2% (w/v) roztworem BSA na 30 minut z łagodnym mieszaniem z platformy kołyskowej.
- Wysuszyć szkiełko, wykonując krótkie wirowanie (200 - 300 x g przez 1 min) za pomocą dostępnej w handlu mikrowirówki przystosowanej do szkiełek mikroskopowych. Alternatywnie osusz szkiełko, delikatnie stukając w ręcznik papierowy.
- Inkubacja ekstraktu próbki multianalitu z mikromacierzą
- Ustaw szkiełko w komercyjnej kasecie hybrydyzacyjnej mikromacierzy z 24 dołkami dla wielu mikromacierzy; postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy.
- Po zmontowaniu szkiełka i kasety należy odpipetować do 50 μl ekstraktu próbki lub rozcieńczyć go w TBSTRR do każdej studzienki kasety.
- Powtórzyć krok 7.2.2 dla każdej próbki, która ma być poddana analizie.
- Jako ślepą próbę należy odpipetować 50 μl buforu TBSTRR do co najmniej dwóch oddzielnych studzienek kasety.
- Inkubować w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę z mieszaniem przez pipetowanie co 15 minut lub pozostawić pod łagodnym wstrząsaniem. Alternatywnie inkubować przez 12 godzin w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Użyj innych uszczelek inkubacyjnych w funkcji wzoru mikromacierzy. Czas i temperatura inkubacji w kroku 7.2.5 są parametrami empirycznymi, które zwykle zależą od powinowactwa i kinetyki wiązania każdego sparowanego antygenu-przeciwciała.
- mycie
- Wyjmij próbki, odkładając kasetę i ostrożnie uderzając nią o czysty, chłonny papier.
- Umyj studzienki, dodając do każdej z nich 150 μl TBSTRR i wyeliminuj bufor, jak powyżej.
- Powtórz krok 7.3.2 jeszcze trzy razy.
- Inkubacja z przeciwciałami detektora fluorescencyjnego
- Dodać 50 μl mieszaniny przeciwciał zawierającej 17 przeciwciał przeciwko szczepowi sinic, z których każde jest znakowane fluorochromem w TBSTRR z 1% (w/v) BSA. Oznaczyć stężenie każdego przeciwciała fluorescencyjnego w mieszaninie (od 0,7 do 2 μg/ml), wykonując doświadczenia miareczkowania każdej pary antygen/przeciwciało.
- Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia, jak opisano w kroku 7.2.5, lub przez 12 godzin w temperaturze 4 °C.
- Wymywanie przeciwciał fluorescencyjnych
- Usunąć fluorescencyjne niezwiązane przeciwciała, jak w kroku 7.3.
- Zdemontuj kasetę i zanurz szkiełko w 0,1x PBS (np. w probówce 50 ml) w celu szybkiego spłukania.
- Wysuszyć szkiełko jak w kroku 7.1.3.
8. Skanowanie w poszukiwaniu fluorescencji
- Zeskanuj szkiełko w poszukiwaniu fluorescencji przy maksymalnym piku fluorescencji emisyjnej dla barwnika fluorescencyjnego dalekiej czerwieni w skanerze fluorescencji. Wykonaj kilka zdjęć mikromacierzy przy różnych parametrach skanowania, zazwyczaj poprzez obniżenie wartości wzmocnienia lasera.
nuta: Unikaj nasyconych plam (> 65 000 zliczeń fluorescencji) - są one poza skalą i mogą powodować błędy ilościowe.
Tabela 1. Lista przeciwciał (abs) i szczepów sinic użytych do produkcji CYANOCHIP.
| Kod Ab | Immunogen (szczep) | porządek | siedlisko | Średni | Warunki kultury |
| Zobacz materiał K1 | Anabaena sp. z o.o. | Nostocales | nieznany | BG11 i azotany | 30 ºC, światło ciągłe |
| Zobacz materiał K2 | Anabaena sp. z o.o. | Nostocales | nieznany | BG11o | 30 ºC, światło ciągłe |
| Zobacz materiał K3 | Microcystis flosaquae (Microcystis flosaquae) | Chroococcales (Chroococcales) | planktonowy | Zobacz materiał BG11 | 28 ºC, światło ciągłe |
| Zobacz materiał K4 | Microcystis novacekii (mikrotorbiel nowaciowa) | Chroococcales (Chroococcales) | planktonowy | Zobacz materiał BG11 | 28 ºC, światło ciągłe |
| Zobacz materiał K5 | Microcystis aeruginosa (mikrotorbiel arabska) | Chroococcales (Chroococcales) | planktonowy | Zobacz materiał BG11 | 28 ºC, światło ciągłe |
| Zobacz materiał K6 | Aphanizomenon ovalisporum (Aphanizomenon ovalisporum) | Nostocales | planktonowy | BG11o | 28 ºC, światło ciągłe |
| Zobacz materiał K7 | Phormidium sp. z o.o. | Oscylatory | bentosowy | Zobacz materiał BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiod |
| Zobacz materiał K8 | Rivularia sp. | Nostocales | bentosowy | CHU-D | 18 ºC, 16-8 fotoperiod |
| Zobacz materiał K9 | Chamaesiphon sp. | Chroococcales (Chroococcales) | bentosowy | Zobacz materiał BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiod |
| Zobacz materiał K10 | Leptolyngbya boryana | Oscylatory | bentosowy | Zobacz materiał BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiod |
| Zobacz materiał K11 | Tolypothrix distorta (Tolypothrix distorta) | Nostocales | bentosowy | BG11o | 18 ºC, 16-8 fotoperiod |
| Zobacz materiał K12 | Aphanizomenon aphanizomenoides | Nostocales | planktonowy | BG11o | 28 ºC, światło ciągłe |
| Zobacz materiał K13 | Nostoc sp. (Antarktyda) | Nostocales | bentosowy | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperiod |
| Zobacz materiał K14 | Anabaena sp. z o.o. | Nostocales | bentosowy | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperiod |
| Zobacz materiał K15 | Leptolyngbya sp. | Oscylatory | bentosowy | Zobacz materiał BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperiod |
| Zobacz materiał K16 | Tolypothrix sp. | Nostocales | bentosowy | Zobacz materiał BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperiod |
| Zobacz materiał K17 | Planktothrix rubescens (Planktothrix rubescens) | Oscylatory | planktonowy | żaden | żaden |