Barwienie immunologiczne komórek zamkniętych w układzie hydrożelowym 3D

Streszczenie

Źródło: LeSavage, B. L., et al. Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje technikę immunologicznego barwienia komórek zamkniętych w hydrożelu 3D. Kultura hydrożelowa zawierająca nerwowe komórki progenitorowe jest utrwalana, przepuszczalna i traktowana roztworem blokującym, aby zapobiec nieswoistemu barwieniu immunologicznemu. Dodaje się koktajl przeciwciał pierwszorzędowych w celu związania określonych białek, a następnie znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe i barwienie jądrowe. Próbka jest następnie umieszczana na szkiełku podstawowym i obserwowana pod mikroskopem konfokalnym.

Protokół

1. Enkapsulacja komórek w hydrożelach 3D z elastynopodobnych białek (ELP)

1. Przygotowanie form silikonowych
   1. Użyj dziurkacza do biopsji o pożądanej średnicy, aby wykonać otwory w arkuszu silikonowym o grubości 0,5 mm i wyciąć kwadrat wokół każdego otworu. Powtórz dla żądanej liczby foremek.
      UWAGA: Średnicę i grubość form można dostosować do konkretnego zastosowania i warunków hodowli komórkowej. W praktyce w przypadku hodowli komórkowych o wymiarach 50 x 10⁶ komórek/ml zaleca się stosowanie form o grubości 0,5 mm i średnicach 4 mm i 5 mm w celu ekstrakcji odpowiednio DNA/RNA i białek. Do barwienia immunologicznego można zamiast tego użyć stempla do biopsji o średnicy 2 mm, aby utworzyć trzy sąsiednie otwory na kwadratową formę, tak aby można było wybarwić trzy powtórzenia w każdym dołku.
   2. Usuń plastikową folię z każdej strony pojedynczej formy za pomocą pęsety.
      nuta: Unikaj kontaktu z odsłoniętą powierzchnią silikonu, ponieważ zanieczyszczenie może zmniejszyć przyszłą wydajność łączenia plazmowego.
   3. Za pomocą pęsety ułóż taką samą liczbę gołych silikonowych foremek i szklanych szkiełek nakrywkowych (nr 1, średnica 12 mm) w naprzemiennych rzędach na odwróconej pokrywie 48-dołkowej płytki. Po zakończeniu przykryj pokrywę płytki 48-dołkowej, aby uniknąć zanieczyszczenia.
   4. Plazma tlenowa traktuje całą 48-dołkową pokrywę płytki (tj. formy i szkiełka podstawowe). Natychmiast po tym użyj kleszczy, aby odwrócić silikonową formę na sąsiednie szklane szkiełko nakrywkowe. Mocno dociśnij formę, aby zapewnić połączenie. Pozwól pleśniom inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godz.
      nuta: Czas trwania obróbki plazmą tlenową będzie się różnić w zależności od używanego instrumentu. Typowe warunki dla naszego instrumentu to robocze okno ciśnienia gazu w zakresie 0,3-4 mbar, przepływ tlenu gazowego z prędkością 20 cm³/min oraz wystawienie próbki na działanie plazmy przez 10-20 s.
   5. Wysterylizuj formy przez autoklawowanie. Przechowuj formy w temperaturze pokojowej w sterylnym środowisku do czasu użycia.
      nuta: Formy można przechowywać na tym etapie w nieskończoność.
2. Przygotowanie roztworu podstawowego białka podobnego do elastyny
   1. Usunąć liofilizowany ELP z miejsca przechowywania w temperaturze 4 °C. Podgrzej białko do temperatury pokojowej przed otwarciem tubki, aby upewnić się, że przy wielokrotnym użyciu na białku nie tworzy się kondensacja.
   2. Rozpuścić ELP w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w temperaturze 4 °C, przy stałym mieszaniu (tj. wirowaniu) przez noc.
      nuta: Stężenie roztworu podstawowego ELP zostanie dodatkowo rozcieńczone przez dodanie roztworu sieciującego w zdefiniowanym przez użytkownika stosunku objętościowym. Na przykład, aby uzyskać końcowe stężenie ELP na poziomie 3% (w/v), należy przygotować roztwór podstawowy ELP o stężeniu 3,75% (m/v), który zostanie rozcieńczony w stosunku objętościowym 4:1 roztwór ELP do roztworu sieciującego. Dostosuj stężenie w razie potrzeby do pożądanej aplikacji.
   3. Sterylny roztwór podstawowy ELP z filtrem strzykawkowym 0,22 μm. Przechowuj ELP na lodzie, gdy nie jest używany.
3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś sterylne formy za pomocą sterylnej pęsety na 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej.
4. Przygotowanie roztworu podstawowego chlorku tetrakis(hydroksymetylo)fosfoniowego (THPC)
   1. Rozcieńczyć THPC w DPBS tuż przed użyciem. Dostosuj stężenie roztworu THPC do końcowego stężenia ELP i pożądanego współczynnika sieciowania.
      nuta: Zgodnie z protokołem, końcowe stężenie ELP wynoszące 3% (w/v) zostanie uzyskane przez zmieszanie roztworu podstawowego ELP z roztworem THPC w stosunku objętościowym 4:1. Dostosuj w razie potrzeby.
   2. Dodaj 2,6 μl roztworu THPC (80% w wodzie) do 997,4 μl DPBS.
      nuta: To stężenie THPC odpowiada stosunkowi stechiometrycznemu 1:1 grup hydroksylowych na THPC i pierwszorzędowych amin na białku ELP podczas mieszania roztworów w opisanym stosunku objętościowym 4:1 dla końcowego 3% (w/v) hydrożelu ELP. Roztwór THPC jest lepki, a kropelki roztworu mogą przyklejać się do boku końcówki pipety. Aby uzyskać dokładne stężenia, należy unikać takich kropelek podczas rozcieńczania do DPBS. Opróżnij pojemnik podstawowy THPC gazowym azotem, aby zapobiec utlenianiu fosforowodu i dezaktywacji środka sieciującego.
   3. Zmieszaj roztwór, aby wymieszać i utrzymać na lodzie.
   4. Sterylnie przefiltrować roztwór podstawowy THPC za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Rozcieńczyć roztwór podstawowy THPC sterylnym DPBS, aby uzyskać niższe stechiometryczne współczynniki sieciowania (np. 0,5:1 lub 0,75:1).
      nuta: THPC jest wrażliwy na tlen, a rozcieńczony roztwór należy zużyć w ciągu kilku godzin po przygotowaniu.
5. Dysocjuj komórki przez inkubację z trypsyną-EDTA do zawiesiny jednokomórkowej, zagnieżdż komórki i policz komórki ponownie zawieszone w pożywce za pomocą hemocytometru.
   nuta: Dokładne protokoły dla tego kroku będą w dużej mierze zależeć od pożądanego typu komórki i zastosowania. W przypadku nerwowych komórek progenitorowych wykorzystywanych w tym protokole przeprowadzono inkubację 0,025% trypsyny-EDTA w temperaturze pokojowej przez 1,5 minuty. Komórki granulowano w temperaturze 200 x g przez 2 min. Aby zwiększyć żywotność komórek, komórki powinny być zawieszone w normalnych warunkach podłoża. Typowe gęstości komórek stosowane do enkapsulacji komórek wahają się od 1 do 50 x 10⁶ komórek/ml końcowej objętości hydrożelu. Dostosuj w razie potrzeby.
6. Porcję pożądanej liczby komórek umieścić w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
7. Odwirować komórki przy ~200 x g przez 3 min. Ostrożnie odessać supernatant i utrzymać osad komórek na lodzie.
   nuta: Bardzo ważne jest, aby całkowicie odessać cały supernatant, aby złagodzić dalsze rozcieńczenie środka sieciującego ELP i THPC. Konkretne prędkości wirowania będą się różnić w zależności od typu komórki.
8. Ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze podstawowym ELP tak, aby objętość wynosiła 80% objętości końcowej (przy założeniu stosunku 4:1 roztwór ELP do roztworu THPC). Odpipetować 20-25 razy, aby uzyskać jednorodną mieszaninę komórek i ELP.
   nuta: Unikaj chwytania dolnej części rury, aby złagodzić wzrost temperatury i późniejsze przejście fazowe ELP. Każda forma o średnicy 2 mm z trzema powtórzeniami wymaga 7,5 μl końcowej objętości (tj. 6 μl roztworu podstawowego ELP i 1,5 μl roztworu podstawowego THPC) podzielonych równo na 3 otwory (tj. 2,5 μl końcowej objętości na otwór). W przypadku form 4 i 5 mm wymagana jest końcowa objętość odpowiednio 7,5 μl i 15,5 μl.
9. Dodać roztwór podstawowy THPC do zawiesiny komórki/ELP dla pozostałych 20% objętości końcowej. Odpipetować 20-25 razy, aby uzyskać jednorodną mieszaninę.
10. Natychmiast odpipetować odpowiednie końcowe objętości mieszaniny komórek/ELP/THPC do każdej formy ruchem okrężnym. Powtórz dla wszystkich foremek.
11. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodatkowo inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut
    nuta: Pierwszy okres inkubacji ułatwi wstępne sieciowanie hydrożelu przed zwiększeniem temperatury do temperatury powyżej dolnej temperatury krytycznej roztworu ELP (LCST) i wywołaniem jego termicznej segregacji fazowej.
12. Powoli dodawać 750 μl pożywki do hodowli ciepłokomórkowych do każdego dołka 24-dołkowej płytki, unikając rozerwania żeli.
13. Inkubować hydrożele w temperaturze 37 °C przez 7 dni.
    nuta: Zaleca się pełne zmiany pożywki co 1-2 dni w zależności od typu komórki. Aby ograniczyć naprężenia żelu, podczas zasysania medium ze studzienki należy użyć szklanej pipety Pasteura przymocowanej końcówką do pipety o pojemności 200 μl.

2. Immunocytochemia komórek w hydrożelach 3D ELP

1. Przygotować roztwór utrwalający, mieszając 10 ml 16% (w/v) paraformaldehydu (PFA) w 30 ml DPBS. Podgrzać roztwór do temperatury 37 °C.
2. Odessać pożywkę z płytki 24-dołkowej i delikatnie przemyć 1 ml DPBS.
3. Dodać 750 μl roztworu utrwalającego do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Nie używaj inkubatora do hodowli tkankowych, aby uniknąć zanieczyszczenia innych kultur parami PFA.
4. Ostrożnie zassać roztwór utrwalający z każdej studzienki, wyrzucając PFA do odpowiedniego pojemnika na odpady niebezpieczne.
   ostrożność: Narażenie na PFA może powodować podrażnienie skóry i oczu. Nosić rękawice/okulary ochronne i pracować w osłonie przeciwchemicznej.
5. Dodać 1 ml DPBS do każdej próbki. Natychmiast zassać DPBS i wyrzucić do pojemnika na odpady PFA.
6. Przemyć próbki dwukrotnie 1 ml DPBS przez 10 minut każda.
   nuta: Próbki można przechowywać w DPBS w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia po uszczelnieniu płytki Parafilmem.
7. Każdą próbkę należy przepuścić za pomocą 750 μl roztworu do przepuszczalności (100 ml DPBS i 0,25 ml Triton X-100; PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na bujaku przy 15 obr./min.
8. Odessać PBST i dodać 750 μl roztworu blokującego (95 ml PBS, 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 5 ml surowicy i 0,5 ml Triton X-100) do każdej próbki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 godziny na bujaku z prędkością 15 obr./min.
   nuta: Roztwór blokujący powinien zawierać surowicę pochodzącą od gatunku gospodarza, w którym wyhodowano przeciwciała drugorzędowe (np. koza, osioł) i przed użyciem przefiltrowano sterylnie przez filtr 0,22 μm.
9. Przygotować roztwór rozcieńczający przeciwciała (97 ml DPBS, 2,5 g BSA, 2,5 ml surowicy (z tego samego gatunku gospodarza, z którego przygotowuje się EPL) i 0,5 ml Triton X-100). Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe roztworem rozcieńczającym przeciwciała i dodać 500 μl roztworu do każdej próbki. Uszczelnić płytkę preparatem Parafilm i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na bujaku.
   nuta: Przeciwciała pierwszorzędowe Nestin i Sox2 rozcieńczono w stosunku 1:400 w roztworze rozcieńczającym przeciwciała od pierwotnego stężenia producenta.
10. Odessać roztwór przeciwciała z każdej próbki i przemywać próbki PBST przez 60 minut w temperaturze pokojowej na kołysce z prędkością 15 obr./min. Powtórz krok prania 3 razy.
11. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe i 5 mg/ml podstawowego DAPI (1:2 000) za pomocą roztworu rozcieńczającego przeciwciała i dodać 500 μl roztworu do każdej próbki. Przykryć 24-dołkową płytkę folią aluminiową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na kołysce.
    nuta: Ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło, próbki muszą być chronione przed fotowybielaniem na wszystkich kolejnych etapach. Drugorzędowe przeciwciała przeciw myszom i królikom rozcieńczono w stosunku 1:500 w roztworze rozcieńczającym przeciwciała od pierwotnego stężenia producenta.
12. Odessać roztwór przeciwciała z każdej próbki i przemywać próbki PBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej na kołysce. Powtórz krok prania 3 razy.
13. Umieść kroplę twardego medium montażowego na powierzchni szkiełka podstawowego. Za pomocą kleszczy usuń nadmiar roztworu z formy, lekko ocierając krawędź formy o ręcznik papierowy. Ostrożnie umieść formę do góry nogami na podłożu montażowym i unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza.
14. Pozostawić medium montażowe do stwardnienia przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub 4 °C. Przed obrazowaniem należy pozostawić podłoże montażowe do całkowitego zastygnięcia przez 48 godzin, ponieważ współczynnik załamania światła ośrodka będzie się zmieniał w trakcie twardnienia. Uszczelnij próbki do szkiełka przezroczystego lakieru do paznokci, aby złagodzić zanieczyszczenie lub ruch próbki.
15. Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Enkapsulacja komórek w hydrożelach 3D ELP
Filtry strzykawkowe 0,22 μm	Milipory	SLGV004SL
Arkusz silikonu o grubości 0,5 mm	Mikroskopia elektronowa	Nr kat. 70338-05
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	Corning	353047
Jednorazowy dziurkacz do biopsji (2 mm)	Integra Miltex	33-31
Jednorazowy dziurkacz do biopsji (4 mm)	Integra Miltex	33-34
Jednorazowy dziurkacz do biopsji (5 mm)	Integra Miltex	33-35 Rozdział 33-35
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)	Corning	21-031-CM
Nr 1 Szkiełka nakrywkowe szklane 12 mm	Thermo Fisher Naukowy	12-545-80
Chlorek tetrakis(hydroksymetylo)fosfoniowy (THPC)	Sigma-Aldrich	404861-100ML
0,5% Tryspin/EDTA	Rybak termiczny	15400054
Immunocytochemia komórek w hydrożelach 3D ELP
16% (w/v) Paraformaldehyd (PFA)	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer katalogowy: 15701
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Roche	3116956001
DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek)	Sondy molekularne	Zobacz materiał D1306
Serum osła	Laboratoria biologiczne Lampire	Numer katalogowy: 7332100
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom kóz (AF488)	Sondy molekularne	A-11017
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi (AF546)	Sondy molekularne	A-11071
Kozia surowica	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 16210-072
Przeciwciało pierwszorzędowe gniazda myszy	BD Pharmingen	556309
Przeciwciało pierwotne myszy Sox2	Technologia sygnalizacji komórkowej	23064S
lakier do paznokci	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer telefonu 72180
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	Płyta X100-100ML
Vectashield Hardset Medium montażowe	Laboratoria wektorowe	H-1400

Rozdział Rozdział