$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Koniugacja peptydów przeciwciał
UWAGA: Kwas cholowy połączony z NLS (ChAcNLS) może być syntetyzowany u dowolnego komercyjnego producenta peptydów lub na platformie usług syntezy peptydów powiązanej z uniwersytetem.
- W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować roztwór 7G3 o stężeniu 10 mg/ml (~1 mg przeciwciała całkowitego) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,6.
- Rozpuścić sulfosukcynimidylo 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan (sulfo-SMCC) w dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 5-10 mM. Najlepiej sprawdza się dokładne wirowanie roztworu, aby osiągnąć całkowite rozpuszczenie.
- Dodać do probówki zawierającej 7G3 rozpuszczony roztwór siarki-SMCC (zwykle od 5 do 20 μl, w zależności od pożądanego stosunku molowego sulfo-SMCC do 7G3). Zaleca się badanie proporcji sulfo-SMCC-do-7G3 10-, 25- i 50-do-1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Oczyść i zagęścić 7G3 derywatyzowany maleimidem za pomocą urządzenia do ultrafiltracji i wymiany buforu w PBS, pH 7,0. Wirować przy 8 000 x g przez około 5 minut. Wylej przepływ i napełnij PBS, pH 7,0 i ponownie odwiruj.
- Wykonaj to 7-8 razy, aby całkowicie wymienić bufor. Odzyskaj skoncentrowane białko 7G3, umieszczając urządzenie filtrujące do góry nogami w czystej probówce do mikrowirówki. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g. Objętość odzysku powinna wynosić około 0,3 ml.
- Do probówki zawierającej aktywowany maleimidem 7G3 dodać 2-krotny molowy nadmiar ChAcNLS w stosunku do stosunku sulfo-SMCC do 7G3 użytego w poprzednim etapie i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Na przykład, jeśli zastosowano stosunek 10 do 1 sulfo-SMCC do 7G3, użyj stosunku 20 do 1 ChAcNLS do 7G3. Całkowita objętość nie powinna ulec znaczącym zmianom.
nuta: Chociaż ChAcNLS nie powoduje wytrącania się podczas procesu koniugacji, jest to możliwość, która może wystąpić w przypadku innych peptydów. Obserwuj probówkę podczas reakcji pod kątem oznak wytrącania się, które najprawdopodobniej powstaje, gdy peptydy są hydrofobowe. W takich przypadkach warto ponownie przyjrzeć się peptydowi będącemu przedmiotem zainteresowania w celu zaprojektowania zmian zapewniających zwiększoną hydrofilowość.
- Zagęścić 7G3-ChAcNLS za pomocą urządzenia ultrafiltracyjnego do żądanego stężenia i wymiany buforowej w PBS pH 7,4 (patrz krok 1.4). Wydajność odzysku białka całkowitego powinna wynosić ≥ 75% pierwotnego materiału wyjściowego.
- Przeprowadzić elektroforezę w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) w celu oceny skonstruowanych kandydatów na 7G3-ChAcNLS przy użyciu 12% żelu poliakryloamidowego (zapewnia wystarczającą separację sprzężonych łańcuchów ciężkich i lekkich ChAcNLS od łańcuchów niesprzężonych). Wymieszać 10 μg 7G3-ChAcNLS w buforze ładującym PAGE zawierającym 2 μl β-merkaptoetanolu i załadować do studzienki.
- Ustaw odpowiednie napięcie (120 V przez 1 godzinę dla żelu 12%) i uruchom elektroforezę. Przerwij elektroforezę, gdy czoło barwnika Coomassie dotrze do dna żelu.
nuta: Nie pozwól, aby przód barwnika Coomassie spływał z żelu.
- Usunąć żel z aparatu do elektroforezy i spłukać roztworem odbarwiającym zawierającym 10% v/v lodowatego kwasu octowego i 20% v/v metanolu.
- Zrób zdjęcie żelu i linijką i zmierz odległość (cm) migrowaną dla wzorców i koniugatów 7G3. Oblicz wartość współczynnika retencji (Rf), która jest odległością migrowaną podzieloną przez długość żelu (od miejsca, w którym białko jest ładowane do frontu migracji Coomassie). Wykreślić masę cząsteczkową (MW) w logarytmie w stosunku do wartości Rf z każdego wzorca białka i ekstrapolować wielkość koniugatów 7G3.
- Oblicz liczbę peptydów na przeciwciało, dzieląc różnicę w MW między koniugatami 7G3 a niezmodyfikowanym 7G3 przez 1768,5 g/mol (MW ChAcNLS).
- Wykonaj cyfrowe zdjęcia żelu barwionego Coomassie i wykonaj analizę densytometryczną. W tym momencie wybór wiodącego kandydata może opierać się na AC z maksymalną liczbą cząsteczek ChAcNLS, która nie zawiera znaczących gatunków zagregowanych.
2. Mikroskopia konfokalna do oceny akumulacji wewnątrzkomórkowej
UWAGA: Ważne jest, aby przetestować selektywność komórek wewnątrzkomórkowych akumulacji mAb modyfikowanych peptydami przed opracowaniem preparatów o interesującym ładunku. Ponieważ wykazano również, że Tat ma skłonność do niespecyficznej penetracji komórek, warto najpierw przeanalizować akumulację wewnątrzkomórkową i selektywność komórek przed podjęciem kosztownych etapów rozwoju z drogimi ładunkami. Z tego powodu Procedura 1 powinna również modyfikować nieistotne kontrolne mAb specyficzne dla danej izotypu. W pozostałej części protokołu będziemy pracować z AC zmodyfikowanymi za pomocą 10 cząsteczek ChAcNLS na przeciwciało. Schemat zawierający kluczowe kroki dla procedur 2 i 3 jest opisany na rysunku 1.
UWAGA: Ten etap protokołu obejmuje obchodzenie się z paraformaldehydem i manipulowanie nim. Podczas obsługi należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
- Traktuj docelowe komórki TF-1a 200 nM 7G3-ChAcNLS, w tym zmodyfikowanymi kontrolnymi mAb. Inkubować 5 x 106 komórek antygenowo-dodatnich z koniugatami przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Po 1 godzinie usunąć supernatant i przemyć 1 ml 3x w lodowatym PBS. Dodać świeżą pożywkę i inkubować przez dodatkową godzinę w temperaturze 37 °C.
- Po dodatkowej godzinie usuń supernatant i przemyj 3x w 1 ml lodowatego PBS. Dodać 0,5 ml PBS zawierającego 0,25% trypsyny i kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C przez 3 do 30 minut.
nuta: Podczas wstępnych testów pilotażowych zaleca się, aby nie trypsynizować komórek w celu określenia różnic w akumulacji wewnątrzkomórkowej AC. Protokół ten promuje stosowanie trypsyny, a my pokazujemy, w jaki sposób poprawia to ocenę skuteczności akumulacji wewnątrzkomórkowej różnych kandydatów na AC.
- Przetestuj różne czasy inkubacji, sprawdzając wzrokowo, czy wszystkie komórki są odłączane. Ponadto inkubować podwielokrotności komórek z roztworami barwiącymi żywotność i przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej.
- Zneutralizuj trypsynę za pomocą 1,5 ml pożywki dla hodowli komórkowych RPMI 1640/10% płodowej surowicy bydlęcej. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i przemyć 3x w 0,5 ml lodowatego PBS.
- Utrwalić komórki w 0,5 ml PBS zawierającym 1% paraformaldehydu i 1% sacharozy na lodzie przez 30 min. Umyć komórki 3x w 0,5 ml lodowatego PBS i odwirować przy 250 x g przez 5 min. Przepuszczalność komórek w 0,5 ml PBS zawierającym 0,15% Triton X-100 przez 5 min na lodzie. Umyj komórki w lodowatym PBS i powtórz wirowanie.
- Zawieś komórki w 0,1 ml PBS zawierającym 2 μg/ml (lub stężenie zalecane przez producenta) antymysiego (specyficznego dla izotypu) drugorzędowego przeciwciała poliklonalnego Fc sprzężonego z AlexaFluor 647 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Wirować przy 250 x g przez 5 minut i myć komórki 3x w 0,5 ml lodowatego PBS. Zawieś komórki w 0,5 ml PBS.
pauza: Komórki można przechowywać w lodówce.
nuta: Niezbędne jest wybranie przeciwciała drugorzędowego, które rozpoznaje prawidłowy izotyp interesującego nas mAb. AF647 został wybrany ze względu na jego emisję dalekiej podczerwieni, która nie zakłóca barwienia jądra jodkiem propidyny (PI).
- Dodać PI do stężenia 10 μg/ml do pojemnika z komórkami. Następnie zamontuj 1 x 105 komórek na szkiełkach za pomocą nośnika montażowego i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
- Zbadaj komórki za pomocą obiektywu zanurzeniowego Plan Apo 60X NA 1.42 w odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. Wykrywanie fluorescencji PI za pomocą lasera argonowego 488 nm i zestawu spektralnego pryzmatu skanującego dla 600 - 650 nm. Do fluorescencji AF647 należy użyć lasera helowo-neonowego o długości fali 633 nm oraz zestawu pryzmatów skaningowych spektralnych o długości fali 650 - 700 nm. Zbieraj sekwencyjne emisje fluorescencji z PI i AF647.
nuta: Użyj tego samego ustawienia podczas oceny i porównania komórek. Będziesz jednak musiał dostosować ustawienia dla komórek trypsynizowanych w porównaniu z komórkami nietrypsynizowanymi.
- Korzystaj z oprogramowania mikroskopowego do pozyskiwania obrazów. Zbieraj obrazy za pomocą szeregowych poziomych odcinków optycznych o wymiarach 1 024 x 1 024 pikseli z 2-krotnym uśrednianiem linii wykonanym w odstępach 0,5 μm na całej grubości komórki. Przedstaw obrazy jako ułożone w stos projekcje z czterech kolejnych warstw z maksymalną intensywnością fluorescencji.
- Analizuj komórki za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Zapisz wzorzec dystrybucji komórkowej koniugatów. W szczególności oceń, czy fluorescencja wewnątrzkomórkowa w cytoplazmie jest zgrupowana i blisko powierzchni komórki, czy też rozproszona i jednorodna. Oceń również względną intensywność fluorescencji na komórkę.
