$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Produkcja i funkcjonalizacja pojemnościowej immunosondy
- Przeciąć drut platynowy pokryty perfluoroalkoksylem (PFA) o długości 25 cm (patrz Tabela materiałów) i usunąć około 5 mm powłoki PFA z jednego końca za pomocą skalpela, uważając, aby nie przeciąć drutu platynowego.
- Włóż odizolowany koniec przewodu platynowego do pozłacanego styku złącza męskiego 1 mm i zaciśnij zęby styku złącza wokół odizolowanego końca przewodu platynowego za pomocą szczypiec półokrągłych (patrz Tabela materiałów).
- przewód platynowy do pozłacanego styku złącza. Uważaj, aby nie użyć nadmiernej ilości lutu.
- Przygotować roztwór dopaminy, rozpuszczając 50 mg chlorowodorku dopaminy w 50 ml 10 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 6,0) przez mieszanie.
- Gdy dopamina całkowicie się rozpuści, umieść końcówkę drutu platynowego w naczyniu zawierającym świeżo przygotowany PBS uzupełniony dopaminą. Podłącz złoty pin złącza do kanału headstage (patrz Tabela materiałów).
- Podłącz elektrodę krążkową chlorku srebra (AgCl) (elektrodę uziemiającą, patrz Tabela materiałów) do kanału uziemiającego w headstage. Umieścić krążek AgCl w naczyniu zawierającym PBS uzupełniony dopaminą i drut platynowy; Uważaj, aby zanurzyć tylko elektrodę tarczową, a nie drut lub lut. Przed kontynuowaniem podłącz bocznik przewodu do kanałów odniesienia stopnia czołowego.
- Otwórz interaktywne oprogramowanie do gromadzenia danych (patrz tabela materiałów). Przygotować protokół potencjału dowodzenia elektroosadzania piłokształtnego z następującymi parametrami: potencjał rozruchowy = −0,6 V; potencjał końcowy = +0,65 V; szybkość skanowania = 0,04 V∙s-1; czas osadzania = 420 s. Rozpocznij protokół osadzania polidopaminy, upewniając się, że wszystkie przewody są prawidłowo podłączone.
- Po zakończeniu osadzania polidopaminy należy wyjąć zmielony osad AgCl i końcówkę drutu platynowego z naczynia, uważając, aby nie naruszyć końcówki elektrody z drutu platynowego. Umieść końcówkę drutu w mikroprobówce zawierającej PBS (pH 7,4) na 2-5 minut, podczas przygotowywania roztworu przeciwciała; Upewnij się, że końcówka drutu nie styka się z bokami ani spodem mikrorurki.
UWAGA: Roztwór przeciwciała można przygotować podczas odkładania polidopaminy; jednak nie należy pomijać przenoszenia drutu platynowego z naczynia zawierającego dopaminę do mikroprobówki PBS po deponowaniu polidopaminy.
- Przygotować roztwór przeciwciał. Połączyć badane przeciwciało z PBS (pH 7,4) w stosunku 1:20 w naczyniu o odpowiedniej wielkości (np. mikroprobówce).
UWAGA: Zastosowane tutaj przeciwciało monoklonalne anty-neuropeptydu Y (anty-NPY) (patrz tabela materiałów) podawano w dawce 1 mg/ml; Przykładowym preparatem przeciwciał byłoby tutaj 4 μL przeciwciała na 76 μL PBS.
- Zanurzyć osadzoną polidopaminą końcówkę elektrody platynowej w roztworze przeciwciała przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej, ponownie upewniając się, że końcówka z drutu platynowego jest zawieszona w roztworze i nie spoczywa na wewnętrznej powierzchni mikroprobówki.
UWAGA: Niedawne wdrożenie tej techniki faworyzowało użycie drutu platynowego elektrodowego bezpośrednio po tym kroku zamiast przechowywania na mokro lub na sucho do późniejszego wykorzystania.
- Po namoczeniu w roztworze przeciwciała krótko przepłucz nowo funkcjonalizowaną końcówkę pojemnościowej immunosondy (sondy CI) w PBS (pH 7,4). Sonda jest teraz gotowa do użycia.
2. Eksperymentalne ustawienie do wykrywania i pomiaru peptydu in vitro
- Umieść funkcjonalną końcówkę sondy CI w komorze przepływowej, uważając, aby w żaden sposób nie naruszyć końcówki elektrody, ponieważ może to spowodować uszkodzenie końcówki sensorycznej sondy.
UWAGA: Komora przepływowa została utworzona przez wlanie elastomeru silikonowego (patrz Tabela Materiałów) do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm z wydłużonym, jajowatym wypełniaczem przestrzeni pośrodku naczynia. Po stwardnieniu jajowaty kształt jest usuwany z elastomeru. Komora jest następnie przepełniana solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) i zapewnia natężenie przepływu 3 ml/min. Upewnij się, że dopływ i odpływ utrzymują poziom płynu w komorze w taki sposób, aby nie zaobserwowano pływowego działania superfusatu. Przepływ musi pozostać na miejscu tak długo, jak długo używana jest sonda CI.
- Przed pierwszym testem eksperymentalnym należy wykonać standardowy przebieg TBS w celu kondycjonowania sondy CI. Ustaw następujący protokół napięcia polecenia: dodatni potencjał krokowy = +100 mV; ujemny potencjał skokowy = −5 mV; czas trwania kroku = 20 ms; Czas nabycia = 600 s.
UWAGA: Ważne jest, aby umożliwić zrównoważenie sondy w początkowej fazie cyklicznego potencjału dowodzenia przed akwizycją danych.
- Stworzyć roztwór interesującego peptydu, używając tego samego TBS, aby utrzymać skład superfuzatu. Skonfiguruj system kolektora, w którym superfusat może być przełączany między TBS a TBS uzupełnionym peptydami bez wprowadzania pęcherzyków do systemu rurek lub komory przepływowej.
UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano syntetyczny peptyd NPY ze świń (patrz tabela materiałów).
- Skonfiguruj protokół akwizycji danych wykrywających peptydy przy użyciu standardowych parametrów TBS (patrz krok 2.2.).
UWAGA: W tej implementacji czas trwania każdego testu eksperymentalnego wynosił 360 s (120 s TBS, 120 s TBS uzupełniony peptydami, 120 s TBS).