1. Przygotowanie przed etykietowaniem
- Przygotowanie i utrzymanie pierwotnych kultur hipokampa
- Przygotuj pierwotne kultury hipokampa o gęstości 150 000 komórek posianych na pokrytych poli-D-lizyną (0,1 mg/ml) szkłach nakrywkowych o średnicy 18 mm. Dostępne są doskonałe przewodniki dotyczące przygotowania zdysocjowanych kultur neuronalnych.
nuta: W razie potrzeby hodowle można poddać działaniu arabinozydu cytozyny (Ara-C, 10 μM z dni in vitro 1 [DIV1]), aby uniknąć proliferacji gleju w preparacie.
nuta: Zamiast poli-D-lizyny można stosować alternatywne odczynniki powlekające, takie jak fibronektyna (1 mg/ml) lub laminina (5 μg/ml).
- Utrzymuj hodowle w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w 2 ml / studzienka pożywki neuropodstawowej uzupełnionej witaminą B27 i 2 mM L-glutaminą.
nuta: W razie potrzeby można zastosować substytuty L-glutaminy (np. Glutamax).
- Co tydzień należy usunąć połowę objętości pożywki i zastąpić ją taką samą objętością uzupełnionego podłoża nerwowo-podstawnego.
- OPCJONALNIE: Transfekcja zmutowanych i/lub znakowanych epitopami receptorów
UWAGA: Neurony powinny być transfekowane co najmniej 3-4 dni przed punktem czasowym analizy, aby umożliwić ekspresję receptora. Wykorzystanie młodych neuronów (DIV6-9) skutkuje lepszą wydajnością transfekcji niż starszych (DIV15-20) neuronów, ale wystarczającą liczbę transfekowanych komórek (>20) można osiągnąć niezależnie od zastosowanego DIV.
- Dla każdego dołka 12-dołkowej płytki rozcieńczyć 1,5 μg plazmidu zawierającego interesujący nas konstrukt w 100 μl świeżej pożywki neurobazalnej bez suplementacji witaminą B27 lub glutaminą w probówce mikrowirówkowej i wymieszać przez szybkie wirowanie.
nuta: Dla udanej transfekcji bardzo ważne jest, aby zastosowane podłoże nerwowo-bazowe było jak najświeższe, najlepiej mniej niż 1 tydzień po otwarciu butelki.
- W drugiej probówce do mikrowirówki wymieszaj 1 μl odpowiedniego odczynnika do lipofekcji w 100 μl świeżej pożywki neuropodstawowej i delikatnie wymieszaj.
nuta: Nie mieszać mieszaniny odczynników do lipofekcji. Stosowanie świeżych odczynników do lipofekcji może poprawić wydajność transfekcji.
- Inkubować probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Dodawać kroplami mieszaninę odczynników do lipofekcji do mieszaniny DNA, delikatnie mieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Dostosuj objętość pożywki w każdym dołku do 1 ml kondycjonowanego podłoża.
- Dodaj kroplami odczynnik do lipofekcji - mieszaninę DNA do studzienki.
- Umieść komórki z powrotem w inkubatorze i odczekaj co najmniej 3-4 dni na ekspresję białka.
nuta: Dla celów opisanych poniżej protokołów internalizacji i recyklingu, neurony hipokampa transfekowano w DIV11-12 z konstruktami wyrażającymi GluN2B oznaczonymi zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w domenie zewnątrzkomórkowej (GFP-GluN2B) i zobrazowanymi w DIV15-16.
- OPCJONALNIE: Inkubacja komórek z lekami (przewlekle lub ostro) w kondycjonowanym pożywce do momentu utrwalenia.
UWAGA: W przypadku leczenia ostrego należy rozpocząć leczenie komórek przed znakowaniem. W zależności od zastosowanego protokołu leczenia farmakologicznego, komórki mogą być utrzymywane w pożywkach zawierających lek podczas sekcji 2. W naszym przykładzie komórki DIV21 poddano chemicznie indukowanemu protokołowi długoterminowego wzmacniania (cLTP) w celu zwiększenia receptora kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego o ekspresji powierzchniowej (AMPAR).
- Wymień kondycjonowane podłoże na roztwór zewnątrzkomórkowy (ECS).
- Traktuj komórki glicyną 300 μM w ECS przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Jako kontrolę, siostrzane szkiełko nakrywkowe należy potraktować ECS (bez glicyny).
- Przemyć komórki 3x roztworem ECS w temperaturze 37 °C i umieścić komórki w ECS (bez glicyny) w inkubatorze komórek na 20 minut przed kontynuacją czynności opisanych w sekcji 2.
UWAGA: ECS (w mM): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES), 30 glukoza, 0,001 tetrodotoksyna (TTX), 0,01 strychnina i 0,03 pikrotoksyna przy pH 7,4.
2. Znakowanie na żywo receptorów o ekspresji powierzchniowej
- Przygotuj szkiełka nakrywkowe do etykietowania
- Aby zaoszczędzić odczynniki i ułatwić manipulację, przenieś szkiełka nakrywkowe stroną komórkową do góry na tackę pokrytą folią parafinową.
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nigdy nie dopuścić do wyschnięcia próbek.
- Przechowuj i utrzymuj kondycjonowane podłoże w temperaturze 37 °C na etapie inkubacji i mycia.
nuta: W przypadku szkiełka nakrywkowego o średnicy 18 mm zaleca się inkubację z 75–100 μl pożywki do znakowania przeciwciał i 120–150 μl do internalizacji/recyklingu.
- Znakowanie receptorów powierzchniowych przeciwciałem pierwszorzędowym
- Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w kondycjonowanej pożywce przez 15 minut w temperaturze RT.
nuta: W przypadku receptorów znakowanych GFP zastosowano królicze przeciwciało anty-GFP w rozcieńczeniu 1:1000. W przypadku endogennego GluA1 zastosowano mysi anty-GluA1 w rozcieńczeniu 1:200.
- Ostrożnie odessać pożywkę zawierającą przeciwciała za pomocą pipety próżniowej i trzykrotnie umyć komórki kondycjonowaną pożywką.
nuta: Jeżeli kondycjonowane media są niedostępne, wszystkie etapy płukania można przeprowadzić przy użyciu PBS+ [sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) zawierająca 1 mM MgCl2 i 0,1 mM CaCl2]. Ręczne zasysanie za pomocą mikropipety może być wykonane, jeśli delikatne zasysanie próżniowe nie jest dostępne.
3. Wyrażenie powierzchni (Rysunek 1)
- Wtórne znakowanie przeciwciał receptorów o ekspresji powierzchniowej
- Umyj raz za pomocą PBS+.
- Utrwal komórki poprzez inkubację z 4% paraformaldehydem (PFA) i 4% sacharozą w PBS przez 7–8 min.
nuta: W przeciwieństwie do innych metod utrwalania, takich jak inkubacja metanolu, PFA nie przenika przez błonę plazmatyczną i dlatego nadaje się do analizy ekspresji powierzchniowej. Aby uzyskać optymalne rezultaty, użyj świeżo przygotowanego PFA. Krótkotrwałe przechowywanie PFA w temperaturze 4 °C lub długotrwałe (do 30 dni) przechowywanie w temperaturze -20 °C jest dopuszczalne w celu odpowiedniego utrwalenia.
ostrożność: PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym. Podczas obsługi należy używać odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej i kaptura ochronnego.
- Umyj komórki trzykrotnie zwykłym PBS.
nuta: Alternatywnie, 0,1 M glicyny może być użyta do mycia PFA zamiast PBS, ponieważ glicyna ugasi wszelkie pozostałe utrwalacze, które mogą zwiększyć tło w preparacie.
- Blokuj niespecyficzne miejsca wiązania przez inkubację z 10% normalną surowicą kozią (NGS) w PBS przez 30 minut w RT.
nuta: Czas blokowania można wydłużyć bez negatywnego wpływu na etykietowanie.
- Inkubować z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu znakowania receptorów znakowanych przeciwciałami pierwszorzędowymi (tj. wyrażanych powierzchniowo).
nuta: W tych przykładach zastosowano rozcieńczenie 1:500 przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z Alexa 555: koziego anty-królika dla receptorów znakowanych GFP i koziego anty-mysiego dla GluA1.
- Umyj komórki PBS 3x.
- Znakowanie receptorów wewnątrzkomórkowych
- Przepuszczalność komórek za pomocą 0,25% Triton X-100 w PBS przez 5–10 minut w temperaturze RT.
nuta: Aby sprawdzić, czy początkowa runda znakowania przeciwciałami zajmuje wszystkie epitopy powierzchniowe, ten etap przepuszczalności można pominąć w siostrzanej kulturze. W takim przypadku nie należy uzyskiwać sygnału dla receptorów wewnątrzkomórkowych. Dodatkowo, aby sprawdzić, czy żadne wewnętrzne receptory nie zostały znakowane w poprzedniej sekcji 2 (tj. pokazując integralność błon plazmatycznych w hodowli), etap przepuszczalności można pominąć w siostrzanej hodowli, a w kroku 2.2.1 można zastosować pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko białku wewnątrzkomórkowemu (np. białko o gęstości postsynaptycznej 95 [PSD-95] lub białko związane z mikrotubulami 2 [MAP2]). W tych warunkach nie należy uzyskiwać sygnału z tego pierwotnego. W tym przypadku zastosowano królicze przeciwciało anty-PSD-95 (1:500).
- Blokuj z 10% NGS w PBS przez 30 minut w RT.
- Znakować receptory wewnątrzkomórkowe poprzez inkubację przepuszczalnych komórek z tym samym przeciwciałem pierwszorzędowym, które zastosowano w sekcji 2.2, rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w RT.
nuta: Rozcieńczenie przeciwciał do znakowania receptorów wewnątrzkomórkowych może być inne niż wymagane do znakowania receptorów o ekspresji powierzchniowej. W przykładzie GluA1 zastosowano to samo rozcieńczenie przeciwciała (1:200).
- Umyj komórki 3x PBS.
- Znakować drugim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w RT.
nuta: W tych przykładach zastosowano rozcieńczenie 1:500 koziego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z Alexa 647 przeciwko myszy (dla GluA1).
- Umyj komórki 3x PBS.
4. Internalizacja (Rysunek 2)
- Internalizacja receptorów powierzchniowych znakowanych przeciwciałami
- Po znakowaniu receptorów z ekspresją powierzchniową i przemyciu przeciwciał (sekcja 2.2), należy utrzymać komórki w kondycjonowanym podłożu bez przeciwciał i zwrócić je do inkubatora (37 °C), aby umożliwić internalizację.
UWAGA: W przypadku receptorów N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) zaleca się 30 minut na internalizację. Jako kontrola, siostrzana hodowla może być utrzymywana z kondycjonowanymi pożywkami w temperaturze 4 °C podczas procesu internalizacji. W tych warunkach powinna nastąpić minimalna internalizacja receptora.
- Znakowanie receptorów powierzchniowych
- Umyj komórki raz za pomocą PBS+.
- Napraw komórki za pomocą 4% PFA i 4% sacharozy w PBS przez 7–8 min.
ostrożność: Podczas obchodzenia się z PFA należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i kaptura ochronnego.
- Umyj komórki 3x zwykłym PBS.
- Blokuj z 10% NGS w PBS przez 30 minut w RT, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
- Inkubować próbki z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze RT w celu znakowania pierwszorzędowych receptorów znakowanych przeciwciałami (tj. receptorów o ekspresji powierzchniowej, które nie zostały zinternalizowane).
nuta: W tym przykładzie do znakowania użyto sprzężonego z Alexa 555 koziego przeciwciała wtórnego przeciwko królikowi (1:500).
- Umyj komórki 3x PBS.
- Znakowanie zinternalizowanych receptorów
- Przepuszczalność komórek za pomocą 0,25% Triton X-100 w PBS przez 5–10 minut.
- Zablokuj niespecyficzne wiązanie przez inkubację z 10% NGS w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Inkubować próbki ze znakowanym fluorescencyjnie przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu znakowania zinternalizowanych receptorów znakowanych przeciwciałami.
nuta: W tym przykładzie do znakowania stosuje się sprzężone z Alexa 647 kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi (1:500).
- Umyj komórki 3x PBS.
5. Recykling (Rysunek 3)
- Internalizacja receptorów powierzchniowych znakowanych przeciwciałami
- Po znakowaniu receptorów z ekspresją powierzchniową i przemyciu przeciwciał (sekcja 2.2), należy utrzymać komórki w kondycjonowanym podłożu bez przeciwciał i zwrócić je do inkubatora (37 °C), aby umożliwić internalizację.
UWAGA: W przypadku receptorów NMDA zaleca się 30 minut na internalizację.
- Blokowanie stabilnych receptorów wyrażających ekspresję powierzchniową
- Aby zablokować epitopy na pierwotnym przeciwciałie przyłączonym do receptorów o ekspresji powierzchniowej, które nie zostały zinternalizowane, należy inkubować komórki z niesprzężonymi fragmentami przeciwciała anty-IgG Fab (H + L) (przeciwko podstawowemu zastosowanemu w sekcji 2.2) rozcieńczonym w kondycjonowanym podłożu (20 μg / ml) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Leczenie to zapobiega przyszłym interakcjom z przeciwciałami drugorzędowymi.
nuta: W tym przykładzie użyto fragmentów Fab przeciwko królikom Goat.
nuta: Eksperyment kontrolny: aby upewnić się, że nastąpiło całkowite zablokowanie receptorów wyrażanych powierzchniowo, siostrzane szkiełka nakrywkowe mogą być inkubowane z Fab i bez niego. Kultury należy utrwalić natychmiast po leczeniu Fab, a obie kultury inkubuje się z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z Alexa 555. Brak sygnału Alexa 555 w inkubowanych komórkach Fab wskazuje na prawidłowe blokowanie przeciwciał.
- Umyj komórki 3x kondycjonowanym medium.
- Inkubować komórki z kondycjonowaną pożywką zawierającą 80 μM dynasore, aby zapobiec dalszej internalizacji i zwrócić komórki do inkubatora (37 °C), aby umożliwić recykling zinternalizowanych receptorów. Dynasore jest inhibitorem GTPazy, który hamuje dynaminę, a tym samym zapobiega internalizacji.
UWAGA: Zalecane jest 45 minut na recykling NMDAR. Należy zauważyć, że Dynasore blokuje wyłącznie proces internalizacji zależny od dynaminy (np. internalizacja NMDAR). Jednak internalizacja innego białka synaptycznego (niezależna od dynaminy) może nadal zachodzić w obecności Dynasore.
- Znakowanie receptorów pochodzących z recyklingu
- Umyj komórki raz za pomocą PBS+.
- Napraw komórki za pomocą 4% PFA i 4% sacharozy w PBS przez 7–8 min.
ostrożność: Podczas obchodzenia się z PFA należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i kaptura ochronnego.
- Umyj komórki 3x PBS.
- Blokuj z 10% NGS w PBS przez 30 minut w RT, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
- Oznakować komórki pierwszym fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w RT.
nuta: W tym przykładzie do znakowania użyto sprzężonego z Alexa 555 koziego przeciwciała anty-królika (1:500).
- Umyj komórki 3x za pomocą PBS.
nuta: Dłuższe mycie PBS (5–10 min) może pomóc w zmniejszeniu tła w preparacie.
- Znakowanie zinternalizowanych receptorów
- Przepuszczalność komórek za pomocą 0,25% Triton X-100 w PBS przez 5–10 minut.
- Blokuj z 10% NGS w PBS przez 30 minut w RT.
- Znakować drugim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS przez 1 godzinę w RT.
nuta: W tym przykładzie do znakowania użyto sprzężonego z Alexa 647 koziego przeciwciała anty-królika (1:500).
- Umyj komórki 3x PBS.
6. Montaż i obrazowanie próbek
- Zamontuj komórki, delikatnie kładąc szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na 12–15 μl odpowiedniego podłoża montażowego.
nuta: Zasysanie nadmiaru nośnika montażowego poprawi jakość obrazów.
- Obrazowanie komórek pod odpowiednim mikroskopem konfokalnym.
nuta: Zaleca się obrazowanie stosu z przy 60-krotnym powiększeniu z krokami co 0,35 μm, obejmującymi całą grubość neuronu.
7. Rozważania dotyczące czasu
- Jest to długi protokół, który można zatrzymać w kilku punktach. W razie potrzeby należy przeprowadzić etapy inkubacji przeciwciał blokujących i pierwotnych przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
- Alternatywnie, w razie potrzeby, użyj mikrofalowego procesora tkankowego, aby znacznie przyspieszyć czas inkubacji po utrwaleniu. Na wszystkich etapach użyj 150 W przy 30 °C dla ustawień "Włącz".
- Aby zablokować, uruchom procesor po 2 minutach "Włączone", 1 minutach "Wyłączone" i 2 minutach "Włączone".
- W przypadku etapów inkubacji przeciwciał pierwotnych i wtórnych uruchom procesor po 3 minutach "Włączone", 2 minuty "Wyłączone" i 3 minuty "Włączone"
UWAGA: Nie obserwujemy żadnej różnicy w jakości po wprowadzeniu powyższych zmian w protokole.
8. Analiza obrazu
- Zaleca się używanie FIJI do przeprowadzania analizy obrazu, ponieważ jest on kompatybilny z wieloma formatami plików. Do naszych danych pozyskano obrazy w formacie pliku Nikon ND2.
- Dostępny jest skrypt makra do łatwej kwantyfikacji partii różnych parametrów wstępnie wybranych przez FIDŻI. W makrze znajdują się następujące kroki:
UWAGA: W tych przykładach zmierzono "intensywność zintegrowaną".
- Otwórz pliki obrazów na FIDŻI i oddzielne kanały.
- Rzutuj Z każdy stos kanałów jako projekcję o maksymalnej intensywności.
- Ustaw dolny próg dla każdego kanału.
UWAGA: Progi powinny być wyznaczone empirycznie dla każdego zestawu danych doświadczalnych. Chociaż każdy kanał może mieć oddzielną dolną wartość progową, ważne jest, aby wartości progowe kanału były konsekwentnie zachowywane dla wszystkich obrazów tego samego zestawu danych.
- Wybierz od trzech do pięciu dendrytów drugo- lub trzeciorzędowych i zapisz je jako obszary zainteresowania (ROI).
- Zmierz zintegrowaną gęstość każdego zwrotu z inwestycji w kanałach powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych.
- Znormalizuj sygnał dla każdego ROI, dzieląc zintegrowaną wartość gęstości kanału powierzchniowego przez kanał wewnątrzkomórkowy.
- Powtórz pomiary dla wszystkich obrazów kontrolnych i eksperymentalnych i znormalizuj wartości eksperymentalne do wartości kontrolnych (np. GluN2B WT lub warunki bez glicyny).
