Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie komórek odpornościowych ze śledziony myszy
UWAGA: Eutanazja naiwnych myszy za pomocą eutanazji za pomocą dwutlenku węgla (CO2). Myszy C57BL/6 zakupione w Jackson Laboratories i wyhodowane we własnym zakresie są używane do eksperymentów w wieku 6-12 tygodni. Do eksperymentów wykorzystuje się zarówno samce, jak i samice myszy.
- Zdezynfekuj skórę myszy 70% etanolem, aby zmniejszyć możliwość przedostania się zanieczyszczeń zewnętrznych do próbki.
- Wypreparuj śledzionę myszy za pomocą narzędzi preparacyjnych, nożyczek chirurgicznych i kleszczy. Zbierz śledzionę i umieść oderwaną śledzionę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z ~5 ml kompletnej pożywki Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) na lodzie.
nuta: Complete RPMI składa się z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy i 1% penicyliny/streptomycyny.
- Aby zebrać śledzionę myszy, wykonaj nożyczkami 5-centymetrowe nacięcie w futrze i skórze wzdłuż lewej strony myszy w połowie odległości między przednimi i tylnymi nogami. Otwórz jamę ciała ~5 cm i usuń śledzionę za pomocą kleszczy. Śledziona ma kolor fasoli i jest dłuższa i bardziej płaska niż sąsiednia nerka.
- Wlać zawartość kroku 1.2 na sterylny filtr 70 μm podłączony do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Mechanicznie oddzielić śledzionę do zawiesiny jednokomórkowej, przepychając śledzionę przez filtr za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml, aż na powierzchni filtra nie pozostanie miazga śledziony.
- Osadzanie splenocytów za pomocą wirówki nablatowej z odchylanym wirnikiem o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie zdekantować supernatant. Granulowane splenocyty pozostają na dnie stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Aby usunąć czerwone krwinki, ponownie zawiesić granulowane splenocyty w 1 ml buforu do lizy amonowo-chlorkowo-potasowego (ACK) na 3 minuty zgodnie z instrukcjami producenta. Dobrze wymieszaj.
- Ugasić bufor do lizy ACK za pomocą 15 ml cRPMI.
- Osadzać limfocyty zgodnie z zaleceniami w kroku 1.4.
- Ponownie zawiesić zawiesinę komórek w 5 ml cRPMI w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umieścić próbki na lodzie.
- Aby policzyć komórki, przenieś 10 μl zawiesiny komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,6 ml i rozcieńcz w stosunku 1:1 roztworem błękitu trypanowego. Następnie przenieś do hemocytometru lub automatycznego systemu zliczania komórek.
- Po zliczeniu, w zależności od stężenia komórek w zawiesinie komórek, jak w kroku 1.9, zagnieździć komórki w wirówce stołowej o sile 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby przygotować się do dodania pożywki cRMPI zawierającej barwnik estrowy Indo-1 AM.
- Obliczyć objętość do ponownego zawieszenia komórek, aby uzyskać 10-12 x 106 komórek/ml. Jest to stężenie 2x całkowitej wymaganej liczby komórek.
- Ponownie zawieś komórki w objętości cRPMI obliczonej w kroku 1.11. Umieścić komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z odpowietrzoną pokrywką lub na płytce do hodowli tkankowej.
2. Znakowanie barwnikiem ratiometrycznym Indo-1 i przeciwciałami fluorescencyjnymi
- Zgodnie z instrukcjami producenta dodać 50 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do fiolki zawierającej 50 μg Indo-1 AM. Stężenie roztworu podstawowego wynosi 1 μg/μL.
nuta: DMSO jest dostarczany w mikrofiolkach z zestawem, aby zapobiec utlenianiu DMSO.
- Rozcieńczyć podwielokrotność podstawową (1 μg/μl) do odpowiedniej objętości doświadczalnej (ustalonej w ppkt 1.11) cRPMI w stężeniu 6 μg/ml, o stężeniu 2x. Nie przechowywać Indo-1 w roztworze wodnym.
nuta: Inne z dodatkiem wapnia mogą być stosowane w zależności od potrzeb komórki.
- Odstawić na bok kompletne podłoża z Indo-1 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
nuta: Stosować minimalne stężenie estru Indo-1 AM niezbędne do uzyskania odpowiedniego sygnału. Musi to być miareczkowane dla różnych typów komórek. Zazwyczaj wystarczające jest stężenie między 3-5 μM. W przypadku pierwotnych limfocytów T obciążenie komórek Indo-1 w stężeniu >5 μg/ml zwiększa średnią intensywność fluorescencji (MFI) powyżej logarytmu 6 na spektralnych cytometrach przepływowych. W takim przypadku należy zmniejszyć intensywność lasera ultrafioletowego (UV) i miareczkować Indo-1 do niższego stężenia.
- Rozcieńczyć wcześniej przygotowaną zawiesinę komórek (w kroku 1.12) w stosunku 1:1 w cRPMI, w tym 2x pożywki Indo-1 wykonane w kroku 2.2. Upewnij się, że komórki mają stężenie 5-6 x 106/ml.
nuta: Nie należy farbować niezabarwionych pojedynczych plam kontrolnych lub znaczników powierzchniowych pojedynczych komórek barwienia Indo-1. Dodanie Indo-1 do kontroli przeciwciał z pojedynczym barwnikiem spowoduje utworzenie wielokolorowej próbki ze względu na Indo-1 dodany do pojedynczych barwionych komórek. Włączyć kontrolę dodaną do płytki próbki utworzonej w kroku 2.6 glikolu etylenowego (EGTA) indo-1 (bezwapniowego) glikolu etylenowego.
- Dodać 1 ml komórek/dołka/warunków eksperymentalnych do 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
- Utworzyć pojedynczą barwioną kontrolę dla próbki Indo-1 (bezwapniowej) przy użyciu wcześniej komórek obciążonych barwnikiem Indo-1 i dodać EGTA do końcowego stężenia 2 mM. EGTA chelatuje wapń w zawiesinie komórkowej, dając czystszą próbkę kontrolną.
- Utworzyć kontrolę pozytywną Indo-1 (Indo-1 związaną z wapniem), dodając 50 μM jonomycyny do zawiesiny komórek obciążonej barwnikiem na cytometrze przepływowym. Jonomycyna to przepuszczalny przez błonę jonofor wapnia, który wiąże jony wapnia i ułatwia przenoszenie jonów wapnia do komórek.
- Stwórz studnię do biologicznej kontroli negatywnej bez fluoroforów i barwnika Indo-1.
- Utwórz studzienkę do kontroli pojedynczego barwienia dla wszelkich dodatkowych populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania (przeciwciała zdefiniowane przez użytkownika) przy użyciu fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami w projekcie panelu cytometrii przepływowej. Nie będą one zawierały barwnika ratiometrycznego Indo-1.
- Dodaj przeciwciało blokujące receptor Fc (~2 μg/1 x 106 komórek), zgodnie z instrukcjami producenta, przed dodaniem dodatkowych przeciwciał sprzężonych z fluorochromem do barwienia powierzchniowego.
- Inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Ponownie zawiesić komórki na płytce 12-dołkowej, delikatnie stukając w płytkę co 15 minut.
- Wymieszać i usunąć całą objętość komórek zawieszonych w pożywce z płytki 12-dołkowej. Następnie dodać zawiesinę komórkową do probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
- Granulować komórki w mikrowirówce o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować supernatant i przemyć komórki, dodając 1 ml wstępnie podgrzanego cRPMI. Ponownie zagnieździć osad i zdekantować supernatant.
nuta: Mycie komórek usuwa wszelkie pozostałe przeciwciała blokujące Fc.
- Ponownie zawiesić komórki w 1 ml cRPMI w 1,7 ml probówkach mikrowirówek i inkubować każdą probówkę w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 30 minut przy 5% CO2 , pozostawiając górną część probówki lekko otwartą, aby umożliwić wymianę gazową. Pozwala to na całkowitą deestryfikację wewnątrzkomórkowych estrów AM.
- W razie potrzeby przenieś komórki z powrotem na 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej. W fazie spoczynku można dodać dodatkowe, zdefiniowane przez użytkownika miareczkowane przeciwciała sprzężone z fluorochromem.
nuta: Markery używane w panelu metod to: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 i tetramer CD1d/α-galcer. Markery są wybierane do analizy podzbiorów limfocytów T.
- Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml należy utworzyć główną mieszaninę wszystkich zdefiniowanych przez użytkownika przeciwciał sprzężonych z fluorochromem zgodnie z interesującymi typami komórek przy uprzednio miareczkowanej objętości.
- Dodać obliczoną mieszankę wzorcową na 1 ml objętości komórki, w zależności od miareczkowanych przeciwciał skierowanych do komórek w stanie spoczynku.
nuta: Zaletą barwienia w kroku 2.15 zamiast późniejszego kroku 2.18 jest to, że barwienie w kroku 2.15 skróci całkowity czas inkubacji w eksperymencie. Jednak barwienie w całkowitej objętości 1 ml na kroku 2.15 zwiększa użycie przeciwciał.
- Po odpoczynku granulować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
nuta: Komórki na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej można granulować na płytce za pomocą wirówki płytkowej. W przeciwnym razie umieść komórki w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
- Umyć ogniwa poprzez ponowne zawieszenie osadu w 1 ml zimnego cRPMI o temperaturze 4 °C i ponownie zagnieździć ogniwa, jak w kroku 2.16. Umieść komórki na lodzie.
nuta: W przypadku barwienia powierzchni komórek oddzielnie, po deestryfikacji w kroku 2.18, potrzebna jest mniejsza objętość przeciwciała. Barwienie powierzchni na tym etapie można przeprowadzić po fazie spoczynku w buforze zimnego przepływu (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco z dodatkiem 1% FBS), przy użyciu przeciwciał zdefiniowanych przez użytkownika, na lodzie przez 30 minut. Umyj ogniwa po barwieniu w cRPMI, jak w kroku 2.17.
- Dodać do próbek barwnik żywotności Ghost540 rozcieńczony w stosunku 1:7,500 w DPBS zgodnie z instrukcjami producenta. Ciepło zabija komórki w temperaturze 55 °C na bloku grzewczym w celu pojedynczej barwionej kontroli żywej/martwej.
nuta: Żywotność funkcjonalnego barwienia barwnikiem w celu wyeliminowania martwych komórek w analizie cytometrii przepływowej jest wykonywana bez FBS. FBS może wchodzić w interakcje z barwnikami aminowymi zgodnie z instrukcjami producenta.
- Ponownie zawiesić poszczególne próbki w 500 μl cRPMI (bez czerwieni fenolowej) za pomocą rurki przepływowej z polistyrenu o pojemności 5 ml z nakrętką.
nuta: Komórki można pozostawić w temperaturze 4 °C na okres do godziny.
- Ogrzać każdą probówkę o pojemności 5 ml zawierającą komórki, indywidualnie, do temperatury 37 °C, używając kąpieli perełkowej przez 7 minut przed analizą na cytometrze przepływowym, zachowując stały odstęp czasu między próbkami. Użyj timera.
3. Rurka do kąpieli z koralikami: utrzymywanie temperatury podczas analizy strumienia wapnia
- Dodać koraliki do kąpieli do małej łaźni wodnej bez dodawania wody; podgrzać do temperatury 37 °C.
- Ostrożnie przeciąć stożkową probówkę o pojemności 50 ml na pół, w miejscu oznaczenia 25 ml, żyletką; wyrzuć górną część probówki.
- Napełnij przepołowioną rurkę w 3/4 wysokości koralikami do kąpieli.
- Umieść rurkę utworzoną w kroku 3.2 w wannie perełkowej utworzonej w kroku 3.1. Doprowadzić rurkę i koraliki do temperatury 37 °C.
- Podłączyć kąpiel perełkową do gniazdka elektrycznego obok cytometru przepływowego, aby utrzymać temperaturę w ramach przygotowań do analizy próbki.
- Dodaj stożkowy stojak styropianowy o pojemności 50 ml, aby przytrzymać jedną probówkę, aby ustawić probówkę na miejscu podczas pracy na cytometrze przepływowym. Wyeliminuje to konieczność ręcznego przytrzymywania rury przez cały czas trwania analizy krzywej.
