Test do ilościowego określenia wiązania ludzkich norowirusów VLP z bakteriami jelitowymi

Streszczenie

Źródło: Madrigal, J. L., et al. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Komensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje test do ilościowego oznaczania ludzkich cząsteczek wirusopodobnych do norowirusa (VLP) wiążących się z ludzkimi bakteriami jelitowymi. Zawiesiny bakteryjne miesza się z VLP i inkubuje, aby umożliwić tworzenie kompleksów VLP-bakterii. Kompleksy są następnie znakowane przeciwciałami specyficznymi dla VLP znakowanymi fluoroforem, a następnie wizualizacją i kwantyfikacją opartą na cytometrii przepływowej w celu zidentyfikowania procentu bakterii związanych z VLP.

Protokół

1. Test przyłączania bakterii VLP

UWAGA: Ludzkie norowirusy VLP stanowią zagrożenie na poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-2, a wszystkie prace z udziałem VLP powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przygotowanie kultur bakteryjnych przed testem przyłączania powinno być przeprowadzone w warunkach bezpieczeństwa odpowiednich dla organizmu.

1. Przygotowanie odczynnika
   1. 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
      1. Przygotuj 1 l 10x PBS, rozpuszczając opakowanie w 1 l wody dejonizowanej (DI).
      2. Roztwór w autoklawie przez 30 min.
      3. Przygotuj 1x roztwór, rozcieńczając powyższy roztwór w stosunku 1:10 w wodzie DI.
      4. Filtr Wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,22 μm i przechowując w temperaturze pokojowej.
   2. 5% BSA
      1. Dodać 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w proszku do 100 ml PBS, aby uzyskać 5% (w/v) roztwór.
      2. Wymieszaj roztwór, wirując lub używając metalowego mieszadła na mieszance, aż grudki się rozpuszczą.
      3. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm.
      4. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
   3. Bufor barwiący cytometrii przepływowej (FCSB)
      1. Przefiltruj zakupiony FCSB (patrz tabela materiałów) przez filtr 0,22 μm.
      2. Przechowywać pozostały roztwór w temperaturze 4 °C.
   4. 5% bufor blokujący (BB)
      nuta: Za każdym razem przygotowuj świeże.
      1. Dodać 0,5 g BSA do 10 ml sterylnego FCSB.
      2. Odwirować, aby dokładnie wymieszać próbkę i pozostawić na lodzie do czasu użycia.
2. Koniugacja przeciwciał
   1. Sprzęż ludzkie przeciwciało GII przeciwko norowirusowi (patrz tabela materiałów) z r-fikoerytryną (PE) za pomocą zestawu do znakowania przeciwciał R-PE zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
   2. Sprzężone przeciwciało należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości w teście przyłączania bakterii VLP.
      nuta: Przeciwciało pierwszorzędowe należy miareczkować przed użyciem w teście przyłączania bakterii VLP w celu określenia właściwego stężenia niezbędnego do analizy cytometrii przepływowej. Miareczkowanie przeciwciał należy wykonywać za każdym razem, gdy przeprowadzana jest reakcja koniugacji i dla każdej bakterii użytej w teście przyłączania.
3. Miareczkowanie przeciwciał
   1. Rozcieńczyć sprzężone przeciwciało GII przeciwko ludzkiemu norowirusowi 100-krotnie, z początkowym rozcieńczeniem 1:100 i końcowym 1:600 (w sumie sześć rozcieńczeń).
   2. Wykonać test przyłączania wirusa zgodnie z poniższym opisem z następującym wyjątkiem: w kroku 1.5.7 ponownie zawiesić osad bakteryjny w 350 μl 5% BB.
   3. Podzielić próbkę na siedem podwielokrotności o objętości 50 μl.
   4. Dodać 50 μl każdego rozcieńczenia przeciwciała do jednej probówki.
   5. Dodaj 50 μl 5% BB do siódmej probówki jako niebarwioną kontrolę.
   6. Przeprowadzić cytometrię przepływową na wszystkich próbkach zgodnie z poniższym opisem.
   7. Porównaj rozcieńczone próbki przeciwciał z niebarwionymi kontrolami i ze sobą nawzajem. Do kolejnych testów należy wybrać najniższe stężenie przeciwciał, które nie powoduje spadku lub utraty sygnału dodatniego.
4. Przygotowanie bakterii
   1. Hoduj bakterie w 40 ml odpowiedniej płynnej pożywki w odpowiednich warunkach atmosferycznych, aż bakterie znajdą się w fazie stacjonarnej.
      1. Kultury Enterobacter cloacae hodować tlenowo przez noc w bulionie Luria w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min, aby osiągnąć fazę stacjonarną.
      2. Hoduj kultury Lactobacillus gasseri w bulionie De Man, Rogosa i Sharpe (MRS) w czarnych probówkach z nakrętką bez wstrząsania w łaźni wodnej ustawionej na 37 °C przez 18 godzin, aby osiągnąć fazę stacjonarną.
   2. Przenieść kultury w fazie stacjonarnej do oczyszczenia stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować próbki o masie 2 288 x g przez 10 minut w celu osadzenia bakterii.
   3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić go w 13 ml jałowego 1x PBS. Powtórz ten krok prania, w sumie dwa prania.
   4. Ponownie odwirować próbki, usunąć supernatant i ponownie zawiesić próbki w 20 ml 1x PBS.
      nuta: Jeśli osad komórkowy jest mały, objętość ponownego zawieszenia można zmniejszyć.
   5. Zmierz OD₆₀₀ kultury.
   6. Korzystając z krzywej wzorcowej, oznacz jednostkę tworzącą kolonię (CFU) na ml przemytej kultury.
   7. Rozcieńczyć bakterie 1x PBS, aby dostosować stężenie kultury do 1 x 10⁸ CFU/ml.
   8. Przenieść 1 ml kultury bakteryjnej 1 x 10⁸ jtk/ml do wymaganych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
   9. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 5 minut.
   10. Zawiesić osad bakteryjny w 1 ml sterylnego 5% BSA.
   11. Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C ze stałym obrotem.
5. Załącznik wirusa
   1. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2, dodaj 10 μg VLP ludzkiego norowirusa (HuNoV) (patrz Tabela materiałów) do każdej probówki zawierającej bakterie zawieszone w PBS i dokładnie wymieszaj przez pipetowanie.
      nuta: Stężenie VLP różni się w zależności od preparatu VLP. W związku z tym objętość dodawana do bakterii będzie się różnić w zależności od partii preparatu i powinna być odpowiednio dostosowana, tak aby 10 μg było dodawane do każdej probówki w eksperymencie. W przypadku kontroli tylko bakterii (np. próbek bez VLP) dodać objętość PBS, która jest równa objętości VLP dodanej do próbek eksperymentalnych.
   2. Inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C ze stałą rotacją.
      UWAGA: Podczas inkubacji używany jest rewolwer rurowy (patrz Tabela materiałów) ustawiony na 40 obr./min.
   3. Po inkubacji odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.
   4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1 ml PBS.
   5. Powtórz kroki prania 1.5.3 i 1.5.4.
   6. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.
   7. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad bakteryjny w 150 μl 5% BB.
6. Barwienie przeciwciałami
   1. Przygotuj świeże 5% BB.
      UWAGA: Wszystkie prace z użyciem przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie powinny być wykonywane w ciemności, a przeciwciało, BB i FCSB powinny być trzymane na lodzie.
   2. Rozcieńczyć ludzkie przeciwciało GII przeciwko norowirusowi w stosunku 1:125 dla próbek E. cloacae i 1:150 dla próbek L. gasseri w 5% BB, przygotowując 50 μl rozcieńczonego przeciwciała na próbkę.
   3. Rozcieńczyć przeciwciało izotypu w taki sam sposób, w jaki ludzkie przeciwciało GII norowirusa rozcieńczono dla każdej bakterii w 5% BB, przygotowując 50 μl rozcieńczonej kontroli izotypu na próbkę.
   4. Podzielić każdą próbkę testową z etapu 1.3.7 na trzy podwielokrotności o pojemności 50 μl, przenosząc je do czystych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
   5. Do pierwszego zestawu próbek dodać 50 μl BB. Ten zestaw będzie zawierał niesplamione (Uns) kontrolki.
   6. Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała GII do drugiego zestawu. Daje to końcowe stężenie przeciwciał 1:250 dla E. cloacae i 1:300 dla L. gasseri. Ten zestaw próbek będzie zawierał próbki barwione (AB).
   7. Dodać 50 μl rozcieńczonego przeciwciała izotypu do trzeciego zestawu. Ten zestaw będzie kontrolkami izotypu (IC). Dobrze wymieszać przez pipetowanie. Próbki należy inkubować na lodzie i w ciemności przez 30 minut.
   8. Odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.
   9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbki w 100 μl FCSB.
   10. Odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbki w 100 μl FCSB.
   11. Odwirować wszystkie próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut.
   12. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbki w 150 μl FCSB.
   13. Przenieść każdą próbkę do probówki FCSB zawierającej 400 μl buforu FCSB o całkowitej objętości 550 μl.
   14. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ich analizy metodą cytometrii przepływowej.
       nuta: Cytometrię przepływową wykonuje się w ciągu 4 godzin od barwienia przeciwciał.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5 ml probówki z okrągłym dnem Polystrene z nasadką sitkową	Corning	352235	Po barwieniu przeciwciał próbki przenosi się do probówek w celu analizy metodą cytometrii przepływowej.
Pakiet AnaeroPack	Thermo Scientific	R681001	Zestaw z gazem beztlenowym stosowany do hodowli Lactobacillus gasseri
Oprogramowanie BD FacsDiva
Cytometr przepływowy BD LSR Fortessa
Albumina surowicy bydlęcej	Odczynniki Fisher	Zobacz materiał BP1605	Służy do cytometrii przepływowej
Bufor barwny do cytometrii przepływowej (FCSB)	BD Nauki biologiczne	554657	Służy do cytometrii przepływowej
Kontrola izotypu IgG2b kappa myszy (eBMG2b), PE, eBioscience	Thermo Fisher Naukowy	12473281	Kontrola izotypu. To przeciwciało jest kupowane w postaci sprzężonej od producenta.
MRS w proszku	BD Nauki biologiczne	Numer katalogowy: 288130	Służy do przygotowania pożywek i hodowli Lactobacillus gasseri.
Norowirus kapsyd G2 Przeciwciało monoklonalne (L34D)	Thermo Fisher Naukowy	MA5-18241	Przeciwciało GII norowirusa. Przeciwciało to jest dostępne tylko w postaci niesprzężonej i dlatego musi być fluorescencyjnie sprzężone przed użyciem w opisanych testach cytometrii przepływowej. W tym protokole wybrano PE, jednak inne cząsteczki fluorescencyjne mogą być wybrane tak, jak najlepiej pasują do cytometru przepływowego używanego przez badacza.
Norowirus GII.4 VLP	Kreatywna biostruktura	CBS-V700	Cząsteczki podobne do ludzkiego wirusa norowirusowego, VLP zostały wygenerowane przy użyciu systemu bakulowirusa i ponownie zawieszone w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 10% glicerolem. Autorzy przeprowadzili niezależną analizę śledzenia nanosightu w celu określenia stężenia cząstek w VLP. Stężenie wynosi około 1011 VLP na mililitr. W oparciu o stężenie białka w VLP, w testach przyłączania VLP dodaje się około 200 cząstek na bakterię.
Odbiornik PBS 10X	Odczynniki Fisher	Zobacz materiał BP665	Rozcieńczyć do 1X przed użyciem.
Zestaw do znakowania przeciwciał SiteClick R-PE	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał S10467	Zestaw do koniugacji służy do oznaczania przeciwciał niesprzężonych.
chlorek sodu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S271	Służy do przygotowania pożywek
Trypton	Oxoid (Oxoid	Zobacz materiał LP0042	Służy do przygotowania pożywek
Rewolwer rurowy	ThermoFisher Naukowy	88881001	Stosowany w teście przyczepiania wirusa: bakterii. Ustaw maksymalną prędkość (40 obr./min).
Ekstrakt drożdżowy	BD Nauki biologiczne	Numer katalogowy: 212750	Służy do przygotowania pożywek
agar	Sigma	A7002	Służy do przygotowania pożywek

powiedział: ) powiedział: